Universität zu Köln

Polarisation des pflanzlichen Aktinzytoskeletts - Profiline in Arabidopsis thaliana und Petroselinum crispum

Schütz, Ingeborg (2003) Polarisation des pflanzlichen Aktinzytoskeletts - Profiline in Arabidopsis thaliana und Petroselinum crispum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Diese Arbeit beschäftigt sich mit Profilin, seinem Vorkommen in Arabidopsis thaliana und Petroselinum crispum und seiner Rolle bei der Pathogenabwehr in zwei Modellsystemen. Es wurden vier vollständige cDNA-Sequenzen von Profilinen aus Petroselinum crispum neu kloniert. Ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen Ähnlichkeit zu bekannten pflanzlichen Profilinen, wobei sie stärkere Ähnlichkeit zur Klasse der somatisch exprimierten Profiline als zu der der in reproduktiven Geweben exprimierten Profiline zeigen. Vier von ihnen teilen jedoch ein Sequenzmerkmal mit Profilinen, die in reproduktiven Geweben exprimiert werden. Mittels Immunlokalisation wurde ein starkes Vorkommen von Profilin in sich entwickelnden Pollen in Blütenknospen von Petroselinum crispum gefunden. Die subzelluläre Lokalisation von Profilin wurde durch Fusion mit einem green fluorescent protein (GFP) untersucht. In Protoplasten, die Profilin-GFP überexprimierten, veränderte sich die Morphologie des Zytoplasmas, es waren keine Zytoplasmastränge sichtbar. Mittels PTGS (post-transcriptional gene silencing) sollte der zelluläre Profilin-Gehalt reduziert werden. In Zellen, deren Profilingehalt mittels dsRNAi der reduziert wurde, blieben GFP-markierte Aktinfilamente länger sichtbar als in Kontrollzellen. In zwei Modellsystemen wurden zytologische Veränderungen bei der Interaktion zwischen Pflanzen und Nichtwirtspathogenen untersucht. Ein Schwerpunkt war die intrazelluläre Lokalisation von Profilin. Durch immunzytologische Färbung konnte die Akkumulation von Profilin an der Infektionsstelle in infizierten Suspensionskulturzellen gezeigt werden. Nach Infektion mit einem Nichtwirtspathogen war kein Anstieg der mRNA von Profilin zu verzeichnen. Um die Funktion von Profilin bei der Infektionsabwehr zu klären, wurde der zelluläre Profilin-Gehalt mittels dsRNAi reduziert. So behandelte Zellen zeigten wenig verändertes Verhalten bei Infektion mit einem Nichtwirtspathogen. Außer Profilin wurden Aktin, PIP2 und kleine GTPasen als an der Pathogenabwehr beteiligte Komponenten untersucht. Die Ausrichtung zellulärer Aktinfilamente zur Infektionsstelle konnte mittels transgener Linien auch für Arabidopsis thaliana gezeigt werden. Es konnte die Lokalisation von GTPase-ähnlichen Proteinen an der Infektionsstelle in infizierten Suspensionskulturzellen von Petroselinum crispum nachgewiesen werden. Funktionelle Untersuchungen mittels aktivitätsveränderter Mutanten der Proteine AtRac2 und AtRac7 ergaben eine mögliche Beteiligung kleiner GTPasen an der Kalloseablagerung in infizierten Zellen. Es konnten keine Profilin-Mutanten in Arabidopsis thaliana identifiziert werden.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    This work deals with profilins which are important actin binding proteins in plants, animals and viruses. Four profilin cDNAs from parsley were cloned. Fusion of one parsley profilin with a green fluorescent protein (PcPRF1-GFP) revealed profilin distribution in the cytoplasm. The predicted amino acid sequences show similarities to known plant profilins. They have higher similarities to plant profilins which are expressed in vegetative tissue than to those of reproductive tissue. On the other hand, four of the five parsley profilins share one sequence characteristic with profilins from pollen, an insertion of two amino acids at a characteristic position. Immunlocalization revealed high profilin content in developing pollen grains in flowers of Petroselinum crispum. Double-stranded RNA interference, a method of post-transcriptional gene silencing (PTGS) was employed to reduce cellular biosynthesis of profilin in Arabidopsis thaliana leaf epidermal cells. Cells with reduced profilin content showed longer prevalence of GFP-labeled actin filaments in detached leaves. In the second part of this work, intracellular changes upon infection with a non-host pathogen were monitored using transgenic Arabidopsis lines and cultured parsley cells infected with Blumeria graminis and Phytophthora infestans, respectively. In Arabidopsis, rearrangment of GFP-labeld actin filaments towards the site of attempted fungal penetration was found. In infected parsley cells from suspension culture, accumulation of profilin at the infection site was shown by use of anity-purified anti-profilin antibodies. No changes in profilin transcript level were found after infection of Arabidopsis thaliana with Blumeria graminis. Transient transformation of Arabidopsis leaf epidermal cells with PRF-dsRNAi did not reveal changes in cell behavior against the pathogen. In infected suspension cultured cells, PIP2 was localized to the nucleus, but not to the infection site. A protein with similarity to the AtRop4 was localized at the infection site in infected parsley cells. Mutant versions of two small GTPases (AtRac2 and AtRac7) of Arabidopsis thaliana were generated resulting in constitutive active and dominant negative protein variants. They were transiently transformed into Arabidopsis thaliana leaf epidermal cells followed by infection with the non-host pathogen Blumeria graminis (single cell assay). Results point to an involvment of Rac in the process of callose deposition. No profilin expression mutants of Arabidopsis thaliana were found.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Schütz, Ingeborgingeborg.schuetz@web.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-11189
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    immunzytochemische Färbung , GTPase , single cell assay , Nichtwirtsbeziehung , dsRNAiGerman
    immunelocalization , GTPase , single cell assay , non-host pathogen , dsRNAiEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Botanisches Institut
    Language: German
    Date: 2003
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 09 February 2004
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 17 Mar 2004 15:58:20
    Referee
    NameAcademic Title
    Schmelzer, ElmonDr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1118

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