Osmosensorische Eigenschaften des Glycinbetain-Transporters BetP aus Corynebacterium glutamicum

Schiller, Dirk (2004). Osmosensorische Eigenschaften des Glycinbetain-Transporters BetP aus Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Unter hyperosmotischem Stress akkumuliert Corynebacterium glutamicum kompatible Solute durch Synthese und/oder Aufnahme aus dem umgebenden Medium. Die Aufnahme der kompatiblen Solute wird durch die vier sekundären Transportproteine BetP, EctP, ProP und LcoP vermittelt. BetP katalysiert den Transport von Betain im Symport mit zwei Natriumionen und ist auf Aktivitäts- und Expressionsebene reguliert. Um die osmosensorischen und osmoregulatorischen Eigenschaften des Carriers zu untersuchen, wurde BetP gereinigt und in Proteoliposomen aus Escherichia coli Phospholipiden rekonstituiert. Durch spezifische immunologische und proteolytische Analysen konnte der unidirektionale Einbau von BetP in die Liposomenmembran nachgewiesen werden. Die N- und C-terminale Extension ist im Lumen der Proteoliposomen lokalisiert. Untersuchungen zur Ionenselektivität der BetP-Aktivierung in Proteoliposomen ergaben, dass der Transporter spezifisch durch osmotisch induzierte Erhöhungen der internen Kaliumionenkonzentration aktiviert wird. Studien über die osmoregulatorischen und osmosensorischen Eigenschaften von C-terminal verkürzten BetP-Varianten lokalisieren die osmosensorische Domäne von BetP innerhalb der endständigen 25 Aminosäuren der C-terminalen Domäne. Durch ortsspezifische Mutagenese innerhalb dieser putativen Sensordomäne konnten Aminosäuren identifiziert werden, die am Mechanismus der K+-abhängigen BetP-Aktivierung beteiligt sind. Untersuchungen zur Osmoregulation von BetP in Proteoliposomen unterschiedlichen Lipidzusammensetzung ergaben, dass die Osmostress-abhängige Aktivität von BetP durch die Lipidumgebung moduliert werden kann. Die Analysen zur Osmosensorik von BetP in Proteoliposomen wurden durch osmoregulatorische Studien der BetP-Varianten in E. coli- und C. glutamicum-Zellen untermauert.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Corynebacterium glutamicum responds to hyperosmotic stress by synthesis and/or uptake of compatible solutes, whose transport is mediated by the four osmoregulated secondary transport systems BetP, EctP, ProP and LcoP. BetP is a Na+/betaine symporter and is regulated at the level of both activity and expression. To study the osmosensory and osmoregulatory properties of the carrier the protein was purified and reconstituted in Escherichia coli phospholipid liposomes. It was demonstrated that Na+ did not stimulate the carrier activation whereas K+ did. Therefore the osmostress-dependent activation of BetP in proteoliposomes depends solely on changes of internal K+ as a measure for varying external osmolalities. Immunological and proteolysis analyses showed that BetP was reconstituted in a right-side-out orientation. By functional analyses of C-terminal truncated BetP variants in proteoliposomes the osmosensory domain was identified within the last 25 amino acids of the carrier. Detailed site directed mutageneses of the sensor domain elucidated the crucial importance of specific amino acids in sensing osmotically induced changes of internal K+ concentrations. Osmoregulatory studies in proteoliposomes of varying lipid content revealed that the molecular mechanism of K+-sensing is modulated by the phospholipid surrounding. The analyses of the K+-dependent BetP activation in the reconstituted system were corroborated by osmoregulatory investigations of recombinant BetP proteins in cells of both E. coli and C. glutamicum.

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