Universität zu Köln

Proteinkinase CK2: neue Einsichten aus kristallographischen und kalorimetrischen Studien

Ermakova, Inessa (2004) Proteinkinase CK2: neue Einsichten aus kristallographischen und kalorimetrischen Studien. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Die Proteinkinase CK2 ist ein heterotetrameres Enzym, das aus zwei katalytischen Untereinheiten (CK2alpha) und zwei regulatorischen Untereinheiten (CK2beta) besteht. Diese sogenannte "CK2 Holoenzym" wird aus einem stabilen CK2beta-Dimer aufgebaut, an das zwei CK2alpha-Ketten gebunden sind, und zwar so, dass sie untereinander keinen Kontakt haben. Im isolierten Zustand existiert CK2alpha als Monomer, isolierte CK2beta liegt dagegen als Dimer vor. CK2alpha gehört zur CMGC-Familie der eukaryontischen Proteinkinasen. Ihre nächsten Verwandten sind die cyclinabhängigen Kinasen und die MAP-Kinasen. Homologe von CK2beta sind dagegen nicht bekannt. CK2 zeigt duale Co-Substratspezifität, d.h. das Enzym kann die beiden Purinnukleotide ATP und GTP als Phosphat-Donator verwenden. CK2 ist sehr wichtig für die Vermehrung und Überleben der Zellen. Durch die Co-Kristallisation dieser Proteine mit dem ATP-Analogon AMPPNP und einem Peptidsubstrat sollte der Mechanismus der Substratbindung und die duale Co-Substratspezifität besser verstanden werden. In der folgenden Arbeit werden die Kristallstrukturen der zwei Proteine hsCK2alpha-deltaC und hsCK2alpha-deltaC-V66A/M163/L dargestellt. In beiden Fällen wurden die binären Komplexe mit AMPPNP strukturell charakterisiert. Das Protein hsCK2alpha-deltaC kristallisierte in der Raumgruppe P21. Die Auflösung lag im Bereich bis zu 2.3 Å. Der wichtigste Befund aus dieser Kristallstruktur war die Entdeckung, daß der beta4/beta5-Loop in "geschlossener" Konformation vorliegt. Im Vergleich dazu besitzt die CK2alpha im Holoenzym dieses strukturelle Element im "offenen" Zustand. Bei der Modellierung der isolierten CK2alpha an die Stelle von CK2alpha im Holoenzym kommt es zu großen sterischen Einschränkungen, wenn sich dieser Loop im "geschlossenen" Zustand befindet. Dies bestätigt sehr gut die neue, noch nicht sehr weit verbreitete Vorstellung, dass CK2alpha und CK2beta in vivo unabhängig voneinander existieren und spezifische biologische Funktionen wahrnehmen können, ohne eine Holoenzym bilden zu müssen. Mit der Lösung der Kristallstruktur der Mutante hsCK2alpha-deltaC-V66A/M163L ist es gelungen, den Grund der dualen Co-Substratspezifität besser zu verstehen. Diese Mutante war geplant worden mit dem Ziel, die Cosubstratspezifität zu schärfen und eine deutliche Präferenz zugunsten von ATP zu erzeugen. Die Erreichung dieses Zieles wurde durch kinetische Messungen bestätigt. Außerdem wurde das Protein in der Raumgruppe P43212 kristallisiert. Bei dem Datensatz der besten Qualität erreichte die Auflösung 1.6 Å. Es wurden strukturelle Veränderungen festgestellt, die mit der verminderten Neigung, GTP umzusetzen, im Einklang standen. Durch kalorimetrische Studien wurde die Thermostabilität von CK2alpha, CK2beta und des CK2-Holoenzymes in Anwesenheit von einigen spezifisch bindenden Stoffen untersucht. Dabei wurde ein stabilisierender Effekt von CK2beta auf CK2alpha festgestellt. Darüber hinaus ist es gelungen durch Isothermale Titrationskalorimetrie und durch Differentiale Rasterkalorimetrie die Bindungskonstante zwischen den beiden Komponenten des Holoenzymes zu bestimmen. Sie liegt im Bereich von 10^8 M^-1. Dieser Wert erlaubt es, über einen nicht-obligaten und transienten Komplex zu sprechen und steht im Einklang mit der früher gelösten Kristallstruktur des humanen CK2-Holoenzyms.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Protein kinase CK2 is a heterotetrameric enzyme composed of two catalytic (CK2alpha) and two regulatory (CK2beta) subunits. This so-called "CK2-holoenzyme" is built from one stable CK2beta-dimer and from two CK2alpha- chains, which are bound to CK2beta-dimer and do not make direct contact with each other. In isolated state CK2alpha exists as a monomer. In contrast CK2beta is vailable as a dimer. CK2alpha belongs to the CMGC group of the eucaryotic protein kinases. Its nearest neighbours are cyclin �dependent kinases (CDK) and the mitogen-activated kinases. Homologous proteins for CK2beta are not established. CK2 shows the dual-co-substrate specifity, i.e. this enzyme can use ATP or GTP as phosphoryl donor. Protein kinase CK2 is a highly conserved protein kinase ever found in all eukaryotic cells investigated so far. The enzyme is important for cell proliferation and biomedically relevant because an overexpression of its catalytic subunit can cause lymphoma. The co-crystallyzation of these proteins with a non-hydrolyzable analog of ATP AMPPNP as a co-substrate and a peptide substrate may help in the investigation of the mechanism of the substrate binding and provide the much better understanding of the dual co-substrate specificity. The present work describes the crystal structures of two proteins hsCK2alpha-deltaC und hsCK2alpha-deltaC-V66A/M163/L. In both cases the binary complexes were charakterised structural with AMPPNP. The crystals of hsCK2alpha-deltaC belongs to the monoclinic space group P21 and the crystal structure was refined up to 2.3 Å resolution. The most important finding from this crystal structure is the discovery of beta4/beta5-loop in closed conformation form in contrast to the open conformation form observed for the CK2alpha subunits of the CK2 holoenzyme. CK2alpha monomers with this closed conformation are unable to bind CK2beta dimers because of sterical reasons. This finding confirms the growing evidence that CK2alpha monomers and CK2beta dimers can exist in vivo independently from the CK2 holoenzyme and may possess physiological role of their own. The solved crystal structure of the mutant hsCK2alpha-deltaC-V66A/M163L affords better understanding of the reason for the CK2 ability to use both ATP and GTP as phosphorylating agents. This mutant posesses the clear preference for ATP binding compared to GTP, which was confirmed by kinetic measurements. The crystalls of this protein belong to the tetragonal space group P43212. The best quality achived for this dataset was up to 1.6 Å resolution. The established conformational changes that occur upon AMPPNP binding comply with the reduced ability to use GTP. The thermostability of the CK2alpha, CK2beta and CK2 holoenzyme was examined by calormetric studies. Thereby the stabilizing effect of CK2beta on CK2alpha subunit was established. Moreover it was succeeded to determine the binding constants between the alpha and beta subunits in the CK2 holoenzyme by the isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry. The values of the binding constant were found to be about 10^8 M^-1. Such values point to a non-obligate and transient komplex and comply with the former solved crystal structure ofEnglish
    Creators:
    CreatorsEmail
    Ermakova, Inessa0221 9910892
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-13717
    Subjects: Chemistry and allied sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Proteinkinase , CK2 , ITC , DSC , KristallstrukturGerman
    Protein kinase , CK2 , ITC , DSC , crystal structureEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Biochemie
    Language: German
    Date: 2004
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 10 January 2005
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 16 Feb 2005 11:25:15
    Referee
    NameAcademic Title
    Schomburg, DietmarProf., Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1371

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