Universität zu Köln

Funktionelle Untersuchungen zur sequenz-spezifischen Rekombination durch die Integrase des Bakteriophagen Lambda in eukaryotischen Zellen

Corona, Teresa (2005) Funktionelle Untersuchungen zur sequenz-spezifischen Rekombination durch die Integrase des Bakteriophagen Lambda in eukaryotischen Zellen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Im Gegensatz zur wild-typ-Integrase des Phagen Lambda katalysieren die Mutanten Int-h und Int-h/218 die sequenz-spezifische Rekombination zwischen zwei attachment-Regionen auch in Abwesenheit von Kofaktoren wie IHF, XIS und negativer gespannter DNA. In dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Effekt das Milieu menschlicher Zellen auf diese Reaktionen hat. Der Vergleich der hier durchgeführten intermolekularen Rekombinationsreaktionen zwischen episomalen Substraten mit den Kinetiken von intramolekularen Reaktionen zeigt, dass offensichtlich keine Präferenz für einen der beiden Reaktionstypen besteht. Es konnte gezeigt werden, dass zwei 21 bp umfassende Rekombinationsregionen, die nur DNA-Sequenz des core-Typs enthalten, durch Integrase Mutanten intermolekular rekombiniert werden können. Die Effizienz dieser Reaktion wurde durch die Anwesenheit von Sequenzen des Arm-Typs mehrfach gesteigert. Integrase-Proteine mit deletierter N-terminaler Domäne, die ebenfalls in dieser Arbeit generiert und getestet wurden, zeigen dagegen kaum Rekombinationsaktivität in eukaryotischen Zellen. Neben der Arm-Bindungs-Funktion der N-Domäne wurde somit auch ein Hinweis auf eine funktionelle Rolle bei der Rekombination erbracht. Bei der Analyse der chromosomalen Rekombinationsaktivität wurde für Int-h/218 nachgewiesen, dass neben der Inversion eines mit attB/attP flankierten Reportergens prinzipiell auch die Integration eines attP-tragenden Vektors in eine im Genom von HeLa-Zellen befindliche attB-Sequenz katalysiert wird. Das heterodimere IHF (Integration Host Factor) ist ein sequenz-spezifisches DNA-bindendes und -biegendes Protein aus E.coli und Kofaktor der Lambda-Intergrase. Es spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von DNA-Transaktionen einschließlich Rekombination, Transkription und Replikation. In eukaryotischen Zellen führt die Ausprägung seiner beiden Untereinheiten nicht zur Ausbildung einer nachweisbaren Proteinmenge. Für den Einsatz in Eukaryoten wurde daher ein rekombinantes IHF Protein (rIHF) untersucht, dass durch die Insertion der nahezu kompletten alpha-Untereinheit von IHF in seine beta-Untereinheit erstellt wurde. Dieses rIHF wurde in HeLa-Zellen stabil ausgeprägt und toleriert. Es wurde vornehmlich im Zellkern lokalisiert und stimulierte in rIHF-transgenen HeLa-Zelllinien die integrative Rekombination episomaler Substrate durch die wild-typ Integrase. Für weitere in vivo Studien mit rIHF wurden transgene Mäuse generiert und analysiert, in denen eine Expression des rekombinanten Proteins jedoch nicht nachgewiesen werden konnte.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    In contrast to wild-type Integrase of bacteriophage Lambda the mutant proteins Int-h and Int-h/218 catalyze site-specific recombination between two attachment sites in the absence of accessory factors such as IHF, XIS and negative DNA supercoiling. In this thesis I examined which effect the human cellular environment exerts on these reactions. The comparison of intermolecular recombination reactions between episomal substrates with kinetics of intramolecular reactions, shows that apparently no preference for one of the two reaction types exists. In addition it was shown that two copies of recombination sites containing only the 21 bp comprising core-type DNA sequence could be recombined by mutant Integrases. The efficiency of this reaction was increased several-fold by the presence of arm-type DNA sequences. It could further be demonstrated that an N-terminal truncated mutant Integrase exhibited only a very weak recombinogenic activity in a eukaryotic background. This result provides a strong hint for a functional role of the N-domain in addition to its arm-type DNA binding. The analysis of chromosomal recombination activity showed for Int-h/218 that it catalyzes not only the inversion of an attB/attP flanked reporter gene but also the integration of an attP containing vector into an attB site placed in the HeLa-genome. The heterodimeric IHF (integration host factor) is a sequence-specific DNA-binding and DNA-bending protein from E.coli that functions as cofactor for the Integrase of bacteriophage Lambda. It plays an important role in a variety of DNA transactions including recombination, transcription and replication. In eukaryotic cells the expression of the two subunits comprising IHF does not lead to the assembly of a detectable amount of protein. A recombinant IHF protein (rIHF), generated by the insertion of the almost complete alpha-subunit of IHF into the beta-subunit, was therefore tested for the use in eukaryotes. This rIHF was stably expressed and tolerated by HeLa cells. It is localized primarily in the cell nucleus and triggers the integrative recombination by wild-type Int in rIHF transgenic HeLa cell lines. For further in vivo studies with rIHF transgenic mice were generated and analyzed. However, the expression of the recombinant protein could not be detected in these mice.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Corona, Teresat.corona@web.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-14880
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    sequenz-spezifisch , Rekombination , Integrase , Lambda , eukaryotischGerman
    sequence-specific , recombination , Integrase , Lambda , eukaryoticEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Genetik
    Language: German
    Date: 2005
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 09 November 2003
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 29 Jun 2005 12:23:02
    Referee
    NameAcademic Title
    Dröge, PeterProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1488

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