Universität zu Köln

Molekulare Mechanismen der MLA-vermittelten Resistenz

Mauch, Stefan (2005) Molekulare Mechanismen der MLA-vermittelten Resistenz. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Die Erkennung von Pathogenen ist für Pflanzen Vorraussetzung, um effektive Resistenz-antworten auszulösen. Ein Erkennungsmechanismus wird genetisch durch Flors Gen-für-Gen Hypothese beschrieben, in der komplementäre Genpaare in Wirt und Pathogen notwendig sind, um eine Isolat-spezifische Resistenzreaktion auszulösen. Diese Gene werden als Resistenz-(R) Gene im Wirt und rassenspezifische Avirulenz (Avr)-Gene im Parasiten bezeichnet. Der Mla-Locus in Gerste kodiert eine allelische Reihe von intrazellulären R-Proteinen, die rassenspezifische Resistenzreaktionen gegen den parasitären Gerstenmehltau Blumeria graminis f. sp. hordei auslösen. Die zur Erkennung erforderlichen Pilzeffektoren werden von AvrMla Genen kodiert. Die ~107 kDa großen MLA Proteine sind modular aufgebaut. Diese Module sind durch eine aminoterminale coiled-coil (CC)-Struktur, eine zentrale Nukleotid-bindende Domäne (NB), eine Region mit Leucin-reichen Wiederholungen (LRRs) und eine carboxyterminale nicht-LRR Region (CT) charakterisiert. MLA Proteine lösen eine Abwehrreaktion aus, die mit einem raschen programmierten Zelltod angegriffener Pflanzenzellen verbunden ist. Die Erkennungsspezifität von MLA Proteinen wird durch die polymorphe LRR-CT-Region determiniert. Obwohl Mla-Resistenzgene offensichtlich allelische Proteinvarianten kodieren, lassen sich diese genetisch in mindestens zwei Gruppen unterteilen, deren Funktion von der Anwesenheit der Pflanzengene Rar1 und Sgt1 entweder abhängig oder unabhängig ist. Die Funktion mindestens eines Mla Resistenzalleles ist zudem vom zytoplasmatischen Chaperon HSP90 abhängig. Fundamentale biochemische Eigenschaften der MLA Proteine wurden in dieser Arbeit mit Hilfe transgener Gerstenlinien analysiert, in denen native 5� regulatorische Promotor-sequenzen die Expression von funktionalen und mit Epitop markierten MLA Proteinen vermitteln. Diese Untersuchungen zeigen, dass der überwiegende Teil von MLA löslich ist und in allen untersuchten Organen der Pflanze nachgewiesen werde kann. Überraschend war der Nachweis von MLA im Wurzelgewebe, da Mehltaupilze ausschließlich epidermales Blattgewebe infizieren. Ergebnisse, nach denen die MLA-Abundanz vom Proteasom kontrolliert wird und MLA-Protein in vitro sumoyliert werden kann, deuten auf eine weitere Ebene in der posttranslationalen Kontrolle hin. Am Beispiel des MLA1 Proteins wurde die Existenz eines hochmolekularen MLA Komplexes von ca. 600-750 kDa mittels Säulenchromatographie und Blau-Nativer Gelelektrophorese nachgewiesen. Dies wird als erster Hinweis auf die Anwesenheit eines homomeren oder heteromeren Erkennungskomplex in gesunden Pflanzen interpretiert, der direkt oder indirekt die Anwesenheit des Pilzeffektors AVRMLA1 registrieren könnte. Die Proteine RAR1, SGT1 und HSP90 sind keine integralen Komponenten dieses Komplexes. Es ist aber möglich, dass diese Proteine eine regulatorische Funktion bei der Faltung von monomerem MLA und/oder der Komplexbildung ausüben. Die beiden exemplarisch untersuchten Proteine MLA1 und MLA6 sind in planta bei höheren Temperaturen intrinsisch instabil. Dieses Ergebnis bietet eine mögliche Erklärung für die häufig beobachtete Temperatursensitivität der durch R-Proteine ausgelösten Resistenzreaktionen. Der mutmaßliche Transkriptionsfaktor WRKY2 in Gerste wurde als Interaktor der CC Domäne von MLA Proteinen über das Zwei-Komponenten-System in Hefe isoliert. Diese Protein-Protein Interaktion erfordert nicht die Anwesenheit weiterer Hefeproteine, da deren Assoziation auch mit in vitro synthetisierten MLA und WRKY2 Proteinen in Co-Immuno-Präzipitationsexperimenten nachgewiesen werden konnte. Da die Expression von WRKY2 durch den Mehltaupilz induziert wird und WRKY2 mRNA in gesundem Blattgewebe nicht nachweisbar ist, werden Modelle diskutiert, in denen dieser Transkriptionsfaktor als eine potentielle Signaltransduktionskomponente der von MLA aktivierten Resistenzantwort funktioniert.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Molecular recognition of pathogens is required to mount efficient plant resistance responses. One recognition system is genetically defined by Flor�s gene-for-gene hypothesis and involves corresponding gene pairs in host lines and pathogen strains. According to this hypothesis, race-specific resistance requires the presence of a racespecific resistance (R) gene in the host and an isolate-specific pathogen effector gene (Avr). The barley Mla locus encodes an allelic series of polymorphic intracellular plant R proteins containing an N-terminal coiled-coil (CC) structure, a central nucleotide binding (NB) domain, followed by a leucine-rich repeat (LRR) region, and a C-terminal non-LRR(CT) region. The CC-NB-LRR-CT type MLA R proteins each recognize isolate-specific fungal effectors (encoded by AvrMla genes) that are released upon attack by the powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. hordei, Bgh) pathogen. MLA proteins trigger immune responses upon AVRMLA detection that is tightly linked to a cell death response of attacked plant cells. MLA recognition specificity was previously shown to be conferred by the polymorphic LRR-CT region. Although Mla R genes appear to be alleles,individual Mla alleles differ in their functional requirements for additional host genes such as Rar1 and Sgt1. In addition, cytosolic HSP90 was recently shown to be genetically required for the function of at least one Mla resistance specificity. Using transgenic lines expressing functional epitope-tagged MLA variants, driven by native 5� regulatory sequences, biochemical fractionation experiments revealed that the majority of MLA is soluble. A minor part of the protein is membrane associated. MLA is constitutively present in all organs of barley plants including roots. Detection of MLA in roots was unexpected because the powdery mildew parasite attacks only leaf epidermal tissue. This work shows the control of MLA abundance by the proteasome and sumoylation of MLA protein in vitro suggesting an additional level of posttranslational control. Using blue native gel electrophoresis and size exclusion chromatography, MLA1 was found to be part of a protein complex of ~600-750 kDa that is present in healthy plants. It remains unclear whether this complex represents MLA oligomers or is a heterocomplex containing other host proteins. Co-immunoprecipitation experiments indicate that HSP90, SGT1, and RAR1 are not MLA complex components. However, these proteins might transiently associate with monomeric MLA to promote its folding and/or association with other host proteins to form MLA-containing recognition complexes. Both tested MLA1 and MLA6 proteins were in planta found to be intrinsically unstable at elevated temperatures. This might be related to the known temperature sensitivity of several other R protein-triggered resistance responses. WRKY2 was recently found to interact with the MLA CC domain in yeast two-hybrid screens. This work also demonstrates an association of MLA with the putative barley WRKY2 transcription factor in in vitro pull-down assays, suggesting that the interaction does not require additional yeast factors. Since WRKY2 expression is known to be pathogen responsive and WRKY2 mRNA is almost undetectable in healthy leaf tissue, I have discussed models in which the presumed transcription factor acts as signaling component in MLA-triggered resistance responses.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Mauch, Stefanmauch@mpiz-koeln.mpg.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-16550
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    MLA, Gerste, Mehltau, ResistenzGerman
    MLA, barley, powdery mildew, resistanceEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > MPI für Züchtungsforschung
    Language: German
    Date: 2005
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 09 January 2006
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 08 Mar 2006 10:05:26
    Referee
    NameAcademic Title
    Schulze-Lefert, PaulProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1655

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