Universität zu Köln

Mechanismen der Substraterkennung der mitochondrialen AAA-Protease Yme1 aus Saccharomyces cerevisiae

Graef, Martin (2006) Mechanismen der Substraterkennung der mitochondrialen AAA-Protease Yme1 aus Saccharomyces cerevisiae. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    ATP-abhängige Proteasen der AAA+-Proteinfamilie vermitteln die energieabhängige Proteolyse zellulärer Proteine. Zwei hochkonservierte AAA-Proteasen in der inneren Mitochondrienmembran üben wichtige Funktionen bei der mitochondrialen Qualitätskontrolle und Biogenese aus. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Substraterkennung von AAA-Proteasen sind allerdings kaum verstanden. Zur Identifizierung und funktionalen Charakterisierung von Substratbindestellen sollte daher die i-AAA-Protease Yme1 aus S. cerevisiae untersucht werden. In dieser Arbeit konnten zwei Substratbinderegionen in Yme1 identifiziert werden, die in der Kristallstruktur einer homologen AAA-Protease den hexameren Ringkomplex an der Oberfläche käfigartig umfassen. Die Substitution von konservierten, negativ geladenen Resten innerhalb einer überwiegend alpha-helikalen Region am N-Terminus der AAA-Domäne(NH-Region) führte zu einer gestörten Substratbindung an diese Region und zu einem generellen Defekt der Proteolyse. Eine zweite Bindestelle wurde durch Domänenaustauschexperimente zwischen Yme1 und der orthologen AAA-Protease IAP-1 aus N. crassa identifiziert. Diese Region setzte sich aus konservierten C-terminalen alpha-Helices der proteolytischen Domäne zusammen (CH-Region) und vermittelte die Proteolyse von Substratproteinen in Abhängigkeit von deren Faltungszustand und Membraninsertion sowie einem substratspezifischen Faktor. Des Weiteren wurde die Funktion des konservierten YVG-Motivs, das in der zentralen Pore von hexameren AAA+-Ringstrukturen lokalisiert ist, für den Abbau von Membranproteinen durch Yme1 über Mutationsanalyse untersucht. Eine hydrophile Substitution von Y354 bewirkte dabei substratspezifische Defekte bei der Bindung von Substratproteinen. Diese führen wahrscheinlich auch zu der beobachteten Abhängigkeit der proteolytischen und in vivo-Aktivität der Protease von Aminosäureresten mit hoher Hydrophobizität an dieser Position. Die Ergebnisse dieser Untersuchung legen ein Modell von alternativen Bindungswegen für die Substratinteraktion von AAA-Proteasen nahe, in dem entfaltete Substrate sequentiell mit zwei oberflächenexponierten Bindestellen interagieren können, bevor sie durch die zentrale Pore des AAA-Rings in die proteolytische Kammer transloziert werden. Die Identifizierung von definierten Substratbindestellen erlaubt es nun, in weiteren Experimenten die molekularen Grundlagen der Substraterkennung durch AAA-Proteasen detailliert zu bestimmen.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    ATP-dependent proteases of the AAA+ protein family mediate the energy-dependent proteolysis of cellular proteins. Two highly conserved AAA proteases anchored to the inner membrane of mitochondria exert crucial functions for mitochondrial protein quality control and biogenesis. However, molecular mechanisms for substrate recognition by AAA proteases are barely understood. In order to define initial steps of substrate engagement by AAA protease the i-AAA protease Yme1 from S. cerevisiae was examined. This study led to the identification of two substrate binding regions. They formed, based on the crystal structure of a homologous AAA protease, a lattice-like structure on the surface of the hexameric ring complex. Substitution of conserved negatively charged residues present in a mainly alpha-helical region at the C-terminal end of the AAA domain (NH-region) caused an impaired substrate binding to this region and led to a complete loss of proteolytic activity. A second region was identified by a domain swapping approach based on Yme1 and the orthologous AAA protease IAP-1 from N. crassa. This region was composed of conserved C-terminal helices within the proteolytic domain (CH-region). Its involvement in proteolysis depended on the folding and membrane insertion of substrates as well as a substrate specific factor. Furthermore, a conserved YVG-motif has been located to the central pore of other hexameric AAA+ ring complexes. Therefore, its role for proteolysis of membrane-bound proteins by Yme1 has been examined by mutational analysis. Hydrophilic substitution of Y354 led to substrate-specific defects on substrate engagement. Consistently, the presence of hydrophobic residues at this position was required for proteolytic and in vivo activity of the protease. Taken together, the mutational analysis suggests alternative pathways for substrate engagement. Misfolded proteins can interact sequentially with surface-exposed binding sites before they are translocated through the central pore into a proteolytic chamber formed by AAA proteases. The identification of substrate binding sites will allow defining molecular determinants of substrate recognition by AAA proteases.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Graef, Martingraefm@smail.uni-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-18412
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Mitochondrien , AAA-Proteasen , Qualitätskontrolle , ATP-abhängige ProteasenGerman
    mitochondria , AAA proteases, quality control , ATP-dependent proteasesEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Genetik
    Language: German
    Date: 2006
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 28 June 2006
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 21 Sep 2006 08:28:10
    Referee
    NameAcademic Title
    Langer, ThomasProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1841

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