Universität zu Köln

Characterisation of cuticular mutants in Arabidopsis thaliana

Faust, Andrea (2006) Characterisation of cuticular mutants in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Plants are protected by the extracellular cuticle, which is made up of cutin, cutan and waxes. The cutin composition of a variety of plants has been known and models of the biosynthesis of cutin monomers exist but not many enzymes have been identified. It is generally accepted that a defect in the cuticle leads to an organ fusion phenotype. In the model plant A. thaliana many fusion mutants have been identified but the identification of genes involved have not lead to a complete picture of the biosynthetic pathway as the fragile Arabidopsis cutin could not be analysed so far. In this thesis a method to analyse cutin in Arabidopsis was developed and different procedures for the analysis were tested. The analysis of totally extracted leaves instead of isolated cuticles was found to be applicable to analyse Arabidopsis cutin. The main lipids in the Arabidopsis cutin were found to be w-OH-fatty acids, a-OH-fatty acids, a-w-diacids and VLCFAs. The optimal depolymerisation step was carried out using methanolic hydrochloric acid and the extraction of lipophilic cutin monomers was performed using hexane. After the subsequent derivatisation with BSTFA the cutin monomers were analysed with GC-MS and GC-FID. The application of the method to the fusion mutant ace/hth revealed together with other background information to the knowledge that it might have a defect in the w-oxidation reaction of w-hydroxy-fatty acids to w-oxo-fatty acids that are putative precursors for a-w-diacids that occur in the Arabidopsis cutin. Another organ fusion mutant that was analysed was bdg. BDG shows homology to a/b hydrolases and the cutin analysis revealed an increased amount of all cutin components by two to three times. This was reconfirmed by previous results from other experiments and the putative function of BDG was suggested to be the transesterification of the cutin components in the cell wall. The upregulation of the cutin biosynthetic pathway, which might be the cause for the increased amount of cutin, could be a compensatory effect of the plant trying to complement the improperly built cuticle. Other putative cuticular mutants were analysed and the cutin composition of pel3, cer13 and FDH:FAE was changed in an unspecific manner. Additional experiments will be necessary to verify the function of the genes as the results of the cutin analyses were rather due to secondary or compensatory effects than being caused directly by the knock-out (pel3 and cer13) or differential expression (FDH::FAE) of genes. The cer10/ecr mutant was characterised because CER10/ECR is a candidate for the last reduction step in the FAE complex on the cytosolic site of the ER. Defects of cer10/ecr were a change in the overall size of the plant, fusions in flowers, a reduced amount of wax on all aerial organs, difference in the sepal surface in comparison to the wild type and occasional organ duplication in flowers. It could be shown, that CER10 is allelic to ECR. So all defects should be caused by a mutation in ECR. Cutinanalysis of cer10 exhibited a reduction in a-hydroxy fatty acids and a slight accumulation in VLCFAs. Analysis of the expression of a-hydroxylases did not reveal the enzyme that is responsible for the a-hydroxylation in the cutin monomers. The analysis of lipids of the seed coat of cer10/ecr showed a primary effect of the lack of ECR as lipids with longer chain lengths are reduced when compared to the wild type but the elongation of VLCFAs in cer10 is not completely abolished. In another project the organ fusion mutant cer13 was characterised. In an approach to map the cer13 gene the map based cloning strategy was chosen and the analysis points to a specific location on chromosome 3 but further fine mapping strategies will be needed to identify CER13. The method of cutin analysis was applied to O.sativa japonica and the cutin composition of rice has been established. In the future it will be possible to analyse putative cutin mutants in rice to identify components of the cutin biosynthesis in O.sativa. The experiments in this thesis investigated the composition of cutin in Arabidopsis. The application of this method will lead to an understanding of the cutin biosynthesis and its involvement in signalling and plant protection. Still further studies on other plant species will be necessary as the cutin composition of Arabidopsis is different than in other plants and the biosynthesis of cutin components in Arabidopsis might not be true for all land plants.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Pflanzliche Oberflächen sind so konzipiert, daß sie die Pflanze optimal schützen. Die Schutzschicht auf der Epidermis besteht aus verschiedenen Komponenten: der Zellwand, der Cuticula und den Wachsen. Die Cuticula ist aus Cutin und Cutan zusammengesetzt, Wachse sind entweder eingelagert (intracuticuläre Wachse) oder bilden auf der Oberfläche Kristalle (epicuticuläre Wachse). Die Zusammensetzung von Cutin und Wachs ist in vielen Pflanzen bekannt, und es gibt Modelle für die Biosynthese der langkettigen Komponenten. Allerdings konnten noch nicht viele Enzyme, die an diesen Stoffwechselwegen beteiligt sind, identifiziert werden. Generell wird angenommen, daß eine defekte Cutinschicht mit Organfusionen bei Mutanten in Zusammenhang steht. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana sind einige Fusionsmutanten bekannt; der Bezug zum Biosyntheseweg der Cutinschicht konnte bisher allerdings nicht hergestellt werden, weil es noch keine Methode zur Analyse der sehr dünnen Cutinschicht in Arabidopsis gab. Mögliche Analysemethoden wurden in dieser Arbeit auf ihre Anwendung in Arabidopsis getestet und auf verschiedene putative Mutanten mit Defekt in der Cutinbiosynthese angewendet. Es wurde die Methode der Komplettextraktion von Arabidopsis-Blättern verwendet mit anschließender Depolymerisierung durch methanolische Salzsäure, die sich als effektiver erwies als die Depolymerisierung mit BF3/Methanol. Die Extraktion der lipophilen Bestandteile erwies sich mit Hexan als optimaler als eine Extraktion mit Chloroform und die Analyse der Monomere wurde mittels GC-MS bzw. mit GC-FID durchgeführt. Die Analyse zeigte, daß das Cutin von Arabidopsis eine von anderen Pflanzen unterschiedliche Zusammensetzung hat. Es besteht hauptsächlich aus gesättigten und ungesättigten a- bzw. w-hydroxilierten Fettsäuren, Disäuren, langkettigen Fettsäuren und Alkoholen. Die Zusammensetzung des Cutins von verschiedenen Mutanten ergab aufschlußreiche Ergebnisse. Das Cutin von ace/hth bestätigte vorhergehende experimentelle Daten, denn es zeigte eine Akkumulation von w-Hydroxy-Fettsäuren und eine leichte Abnahme der Disäuren. Da bekannt ist, daß ace/hth epidermisspezifisch exprimiert wird und die Analyse von allen löslichen Lipiden ergab, daß w-Oxo-Fettsäuren in kleineren Mengen vorliegen und w-Hydroxy-Fettsäuren akkumulieren, ist ACE/HTH ein Kandidat der verantwortlich ist für die Oxidation von w-Hydroxy-Fettsäuren zu w-Oxo-Fettsäuren, die dann zum Einbau in das Cutin zu Disäuren weiteroxidiert werden. Eine weitere Organfusions-Mutante, bei der die Cutinanalyse zu einer Aufklärung der Funktion beitrug, ist bodyguard (bdg), ein Enzym mit Homologie zu a/b Hydrolasen. Eine Anreicherung aller Cutinkomponenten, ebenso wie der epicuticulären Wachse, auf das 2-3fache konnte in dieser Mutante gemessen werden. SEM-Bilder zeigten eine dickere, aber weniger dichte Cuitula abwechselnd mit Abschnitten ganz ohne eine Cuticula. All diese Aspekte führten zu dem Schluß, daß BDG eine Rolle bei der Veresterung der Cutinbestandteile spielen könnte, da das Cutin von bdg nicht korrekt verestert ist und die Pflanze versucht, diesen Defekt durch eine Akkumulation von Cutinmonomeren und Wachsen auszugleichen. Desweiteren wurde cer10/ecr charakterisiert, denn CER10/ECR ist vermutlich verantwortlich für den letzten Schritt der Elongation der langkettigen Fettsäuren im FAE Komplex auf der cytosolischen Seite des ER. Zu den morphologischen Defekten von cer10/ecr zählen veränderte Größe, fusionierte Blüten, reduzierte Wachsmengen auf allen oberirdischen Organen, veränderte Oberfläche der Sepale und gelegentliche Organduplikationen in der Blüte. Es konnte nachgewiesen werden, daß CER10 allelisch ist mit dem publizierten ECR Gen. Somit müssen sich alle Phenotypen auf den Defekt in ECR zurückführen lassen. Die Cutinanalyse von cer10/ecr zeigte eine Reduktion der a-Hydroxy Fettsäuren und eine leichte Akkumulation der langkettigen Fettsäuren. Die Expressionsanalyse von putativen a-Hydroxylasen ergab allerdings noch keinen Aufschluß, welches Enzym dafür verantwortlich sein könnte oder wie ein Defekt in ECR/CER10 dazu führt, daß weniger a-Hydroxy Fettsäuren im Cutin eingebaut werden. Die Analyse der Lipide der Samenschale wies eindeutiger auf den Verlust der ECR-Funktion hin, denn hier waren alle längerkettigen Lipide in geringeren Mengen vorhanden als im Wildtyp. Allerdings ist die Elongation von langkettigen Fettsäuren in cer10/ecr nicht vollständig unterbunden. Im dritten Teil der Arbeit wurde cer13 charakterisiert. Die Klonierung von CER13 wurde durch Eingrenzung des Lokus auf Chromosom III mittels �map based cloning� durchgeführt. Allerdings weisen die morphologischen Veränderungen, die biochemische Characterisierung der Cutinzusammensetzung und die biochemische Analyse der Lipide der Samenschale nicht auf die Funktion von CER13 hin und weiteres Klonieren wird nötig sein. Durch die Applikation der hier angewendeten Cutinanalyse auf Oryza sativa konnte die Cutinzusammensetzung der Unterart Japonica analysiert werden und es wird möglich sein, verschiedene Reismutanten mit defektem Cutin zu analysieren. Mit den Experimenten in dieser Arbeit untersuchte ich die Zusammensetzung von Cutin in Arabidopsis. Die Anwendung dieser Methode wird zum Verständnis der Cutinbiosynthese, der Funktion von Cutinmonomeren in Signalprozessen und dem Schutz der Pflanze vor Pathogenen durch die Cuticula beitragen. Die Analyse und Übertragung des Wissens von Arabidopsis wird allerdings limitiert sein, da das Arabidopsis Cutin ein anderes ist als in den Landpflanzen, in denen es bisher analysiert wurde.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Faust, Andreaandrea.faust@gmx.net
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-18925
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Arabidopsis , Cutin , Wachs , Pflanzliche Oberflächen , OrganfusionenGerman
    Arabidopsis , cutin , wax , organ fusion , polyesterEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Biochemie
    Language: English
    Date: 2006
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 28 May 2006
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 15 Dec 2006 12:04:00
    Referee
    NameAcademic Title
    Krämer, ReinhardProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1892

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