Universität zu Köln

The Transcriptomic Profiling Of Murine Embryonic Stem Cell-derived Mesodermal Cell Lineages And Functional Cardiomyocytes: An Insight Into Mesodermal Patterning

Doss, Michael Xavier (2007) The Transcriptomic Profiling Of Murine Embryonic Stem Cell-derived Mesodermal Cell Lineages And Functional Cardiomyocytes: An Insight Into Mesodermal Patterning. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Summary The underlying basis of vertebrate mesodermal patterning by which the mesodermal cells become sequentially determined to more precisely defined cell fates during embryonic development remains largely unknown and is one of the classical problems in developmental biology. This demands an in-depth analysis of the endogenous signaling cascades and transcription factor networks. Till date, this fascinating puzzle is not yet solved since isolation of pure early stage mesodermal cells was not feasible due to practical difficulties and hence the functional genomics of the mesodermal cells has not yet been successful. Recently, embryonic stem (ES) cells have been proven to be a promising tool to study the early embryonic development in a more physiological context in vitro because of their versatility over the other conventional systems. Furthermore, ES cells may revolutionize medicine by providing an unlimited renewable source of cells capable of replacing or repairing tissues that have been damaged in all degenerative diseases. Using ES cell model in vitro, for the first time pure populations of T Brachyury and BMP-2 expressing mesodermal lineages and mesodermal derived pure and functional cardiomyocytes have been isolated and their entire transcriptomes were profiled using microarrays. To isolate the pure lineage specific cells, stable transgenic ES clones transfected with a targeting vector construct in which the promoter of lineage specific marker (T, BMP-2 or aMHC) drives the expression of both puromycin resistance and enhanced green fluorescence bicistronically with the help of an IRES element were generated. The EBs made from these clones were treated at the onset of the particular transcript expression with puromycin to enrich the respective lineages. Furthermore, analysis of the gene signatures specific to mesodermal cells and cardiomyocytes that defines their unique cellular and genetic identities contributing a major molecular insight into mesodermal patterning has been performed. In addition, a significant number of novel putative transcripts whose functions are unknown but expressed in specific lineages are enlisted. Few of these transcripts were functionally evaluated for their role in germ layer development and patterning. In addition, the purified populations of T Brachyury and BMP-2 mesodermal cells are capable of priming themselves to give rise to cardiomyocytes along with other mesodermal lineages. Interestingly, the BMP-2 positive cells contained predominantly neural crest stem cells (NCSCs) and their lineages namely smooth muscle cells, epithelial cells, melanocytes, and astrocytes along with cardiomyocytes. The transcriptome characterization of ES cell-derived aMHC cardiomyocytes clearly proves that these cells are exhibiting the properties more like the cardiomyocytes developed in in vivo conditions from the point of biological processes and hence are promising candidates for the future cardiac cell replacement therapy. In overall, the part of the work presented here will better contribute substantially to the lineage specific transcriptomic atlas which will shed light in understanding the complex embryonic developmental process.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Zusammenfassung Die grundlegenden Mechanismen des sogenannten �mesodermalen Patternings (Musters)�, durch welches sich mesodermale Zellen während der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren nacheinander zu genau definierten Zelltypen entwickeln, sind weitgehend unerforscht. Für ein genaues Verständnis des �mesodermalen Musters� ist eine eingehende funktionelle Genomanalyse der endogenen Signalkaskaden und der beteiligten Transkriptionsfaktoren erforderlich. Bisher wurde das faszinierende Zusammenspiel dieser Faktoren nicht eingehend untersucht, da eine Isolierung von frühen mesodermalen Zellen aus experimentell-praktischen Gründen schwer durchführbar ist. Bisher existieren folglich diesbezüglich keine erfolgreichen Untersuchungen an mesodermalen Zellen. Aufgrund ihrer in-vitro-Differenzierbarkeit können embryonale Stammzellen (ES-Zellen) als vielversprechendes Modell dienen, um frühe embryonale Entwicklungsprozesse in einem physiologischen Kontext zu studieren. Aufgrund dessen ist das ES-Zell-Modell herkömmlichen entwicklungsbiologischen in vivo-Modellen überlegen. Darüber hinaus können ES-Zellen die Medizin revolutionieren, indem sie als eine unbegrenzte Quelle erneuerbarer Zellen zur Verfügung stehen, die zur Reparatur oder als Ersatz für geschädigtes Gewebe eingesetzt werden können. Solche beschädigten Gewebe kommen in den meisten degenerativen Krankheiten vor. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten aus ES-Zellen zum ersten Mal weltweit reine mesodermale T (Brachyury)- und BMP-2-positive Zellpopulationen sowie von mesodermalen Zellen abstammende, funktionelle Kardiomyozyten gewonnen und deren Transkriptom mittels DNA-Microarrays detailliert analysiert werden. Um diese reinen Zellpopulationen zu gewinnen, wurden ES-Zellen mit IRES-Vektoren stabil transfiziert, die gleichzeitig eine Puromycin-Resistenz-Kassette und eine Reporter-Kassette (grün fluoreszierendes Protein) unter der Kontrolle zellspezifischer Promotoren (T, BMP-2, aMHC) exprimieren. Diese transgenen Zelllinien wurden in vitro zu �Embryoid Bodies� (EBs) differenziert, aus denen nach Puromycinbehandlung die jeweiligen Zelltypen (T-, BMP-2-, und aMHC-positive Zellen) in reiner Form isoliert werden konnten Die Analyse der Microarray-Expressionsdaten führte zur einer Identifikation zellspezifischer Genexpressionssignaturen für mesodermale Zellen sowie für Kardiomyozyten und somit zur Charakterisierung ihrer spezifischen zellulären und genetischen Identität. Diese Untersuchungen gewähren weiterhin einen Einblick in das�mesodermale Musters�. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von Transkripten ermittelt, deren Funktion bisher unbekannt ist. Einige dieser Transkripte wurden funktional bezüglich ihrer Rolle bei der Entwicklung von Keimblättern charakterisiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass reine T Brachyury- und BMP-2-Zellen in der Lage sind, sich zu Kardiomyozyten und anderen gewebsspezifischen Zelltypen mesodermalen Ursprungs zu differenzieren. Interessanterweise wurden neben Kardiomyozyten zusätzlich Neuralleisten-Stammzellen, glatte Gefäßmuskelzellen, Epithelzellen, Melanozyten und Astrozyten nachgewiesen. Die Transkriptomanalyse der aus ES-Zellen abgeleiteten Kardiomyozyten zeigt, dass diese biologische Eigenschaften von in vivo Kardiomyozyten aufweisen und infolgedessen zukünftig für eine zelluläre Ersatztherapie von degenerativen Herzerkrankungen eingesetzt werden könnten. Die vorliegende Arbeit wird zur Erstellung eines zellspezifischen Transkriptom-Atlas führen, der zu einem besseren Verständnis komplexer entwicklungsbiologischer Prozesse beitragen wird.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Doss, Michael Xavierxavi7677@yahoo.com
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-20292
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    mesoderm, cardiomyocytes, embryonic stem cells, transcriptome profiling,English
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Neurophysiologie
    Language: English
    Date: 2007
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 24 April 2007
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 14 Jun 2007 09:05:44
    Referee
    NameAcademic Title
    Hescheler, JürgenProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2029

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