Universität zu Köln

Generierung und Charakterisierung von konditionalen knock-outs des Spleißfaktors Sfrs10 im Mausmodell

Mende, Ylva Christine (2008) Generierung und Charakterisierung von konditionalen knock-outs des Spleißfaktors Sfrs10 im Mausmodell. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    SFRS10 gehört zu der Familie der � für die Spleißreaktion nicht-essentiellen � SR-related-Spleißfaktoren. Über autoregulative Prozesse und die Regulation des Phosphorylierungsstatus wird die Konzentration an funktionellem SFRS10 in Zellen im Gleichgewicht gehalten. SFRS10 ist an der Regulation verschiedener alternativer Spleißprozesse involviert, wobei die Selektion alternativer Spleißstellen von seiner Konzentration abhängt. Eine Beteiligung des Proteins an der Generierung alternativer Spleißprodukte wurde z.B. in der männlichen Keim-bahn und bei neuronal-spezifischen Vorgängen gezeigt. Darüber hinaus fördert SFRS10 über die Bindung eines GA-reichen exonic splicing enhancers (ESE) im zentralen Teil des SMN-Exons 7 dessen Einschluss in die SMN-RNA. Der funktionelle Verlust des SMN1-Gens verur-sacht die autosomal-rezessiv vererbte spinale Muskelatrophie (SMA). Diese neuromuskuläre Erkrankung führt zur Degeneration von α-Motoneuronen im Rückenmark. Der Schweregrad der SMA korreliert mit der Kopienzahl eines zweiten Gens � des SMN2. Wegen einer translational stillen Mutation in Exon 7 werden von SMN2 ~90% aberrante und nur ~10% korrekt gespleißte Volllängetranskripte (VL) generiert. Diese Exon 7 enthaltenden Transkripte codieren � wie auch die von SMN1 generierten � das funktionelle SMN-Protein. Der Spleißfaktor SFRS10 vermag in vitro eine bis zu 80%ige Revertierung des SMN2-Spleißmusters zu induzie-ren. Daher ist SFRS10 ein viel versprechender Kandidat für eine in vivo-Modulation der SMN2-RNA-Prozessierung. Mäuse tragen nur das dem SMN1 homologe Gen Smn, dessen homozygo-ter Verlust in einer frühen embryonalen Letalität resultiert. Bei Expression des humanen SMN2-Transgens zeigen Smn-/--Mäuse einen SMA-ähnlichen Phänotyp. Um das modulierende Potential des Spleißfaktors auf den SMA-Phänotyp in vivo zu analysieren, sollte ein SFRS10-transgenes Smn-/-; SMN2+/+-Mausmodell generiert werden. Untersuchungen an einer bestehenden SFRS10-transgenen Linie ergaben jedoch eine fehlende neuronal-spezifische Expression des SFRS10-Transgens, so dass auf weitere Kreuzungen und Analy-sen verzichtet wurde. Da nur wenig über Sfrs10 und dessen generelles Wirkungsspektrum bekannt war, sollten in vivo � auch in Hinblick auf das Spleißen des murine Smn � die phänotypischen Konsequenzen von Sfrs10-knock-outs untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden konditionale Cre-loxP-vermittelte Sfrs10-knock-out-Mausmodelle generiert und charakterisiert. Der ubiquitäre heterozygote knock-out des Sfrs10 blieb � trotz 30-40%iger Reduktion der Sfrs10-Proteinexpression � ohne ausgeprägte phänotypische Konsequenzen. Sfrs10+/--Männchen wiesen jedoch eine Rever-tierung des Sfrs10-Phosphorylierungsmusters in Testis auf. Dieses Ergebnis weist auf regulative Prozesse zur Kompensation des heterozygoten Sfrs10-Verlustes und auf eine wichtige Funktion des Proteins in diesem Gewebe hin. Der ubiquitäre homozygote Sfrs10-knock-out resultierte in der frühen embryonalen Letalität zwischen E7.5 und E8.25. In frühen Embryonalstadien (E3.5) konnten Sfrs10-/--Embryonen identifiziert werden, die keine phänotypischen Auffälligkeiten zeigten. Homozygote Sfrs10-knock-out-Embryonen an E9.5 und an E8.5 dagegen wiesen starke Entwicklungsretardierungen im Vergleich mit Geschwistern anderer Genotypen auf und zeigten bereits erste Zeichen einer Resorbierung. Der drastische Phänotyp von Sfrs10-/--Embryonen deutet eine essentielle Funktion des Spleißfaktors Sfrs10 während der Embroygenese in post-implantiven Stadien an. Diese Vermutung wird mit dem Nachweis einer ubiquitären Expression im Mausembryo bereits um E7 gestützt. Da das Sfrs10-abhängige Smn-Spleißen und die daraus resultierenden Phänotypen untersucht werden sollten, wurde ein Hb9-Cre-vermittelter Motoneuronen-spezifischer Sfrs10-knock-out vorgenommen. Tiere mit dieser Sfrs10-Deletion zeigten keine phänotypischen Auffälligkeiten. Mit immunhistologischen Untersuchungen wurde die Sfrs10-Deletion nachgewiesen, wobei unklar bleibt, ob alle Motoneuronen von dieser betroffen waren. Die Phänotypisierung solcher Tiere wird mittels weiterer Analysen fortgeführt. Über die Behandlung von murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs; Sfrs10FL/FL) mit rekombinanter HTN-Cre wurde die Sfrs10-Deletion in vitro induziert und deren Wirkung auf das Splei-ßen des Smn untersucht. Über spezifische Primerkombinationen konnte die Generierung eines bisher nicht beschriebenen SmnΔ7-Transkripts vom Smn-Gen gezeigt werden, dessen Expression, verglichen mit dem des VL-Smn, gering war. Die Sfrs10-Deletion bewirkte einen 3-4fachen Anstieg dieses Transkripts. Quantifizierungen der VL-Smn-Transkripte und der Smn-Proteinmenge in Sfrs10-deletierten MEFs zeigten jedoch keine Sfrs10-vermittelten Abweichungen in der Smn-Expression. Diese Ergebnisse sprechen für eine nicht-essentielle Funktion des Sfrs10 bezüglich des Smn-Spleißens. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine essentielle Bedeutung des Sfrs10 während der frühen Embryonalentwicklung hin, während der Spleißfaktor in anderen Geweben und Zellen wie Fibroblasten und Motoneuronen auch in Bezug auf das VL-Smn-Spleißen eine nicht-essentielle Funktion zu haben scheint. Mit der Generierung eines konditional induzierbaren Sfrs10-knock-out-Mausmodells wurde ein in vivo-System etabliert, mit dem weiterhin auch in Hinblick auf das Spleißen des SMN zahlreiche funktionelle Analysen realisierbar sind.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    The SR-related splicing factor SFRS10 is like other members of this family non-essential for the splicing reaction. The SFRS10 concentration in cells is controlled by autoregulative and phosphorylation-dependent processes. Changes in SFRS10 concentration affect splice site selection. SFRS10 has been shown to be involved in alternative splicing in the male germ line as well as in neuronal-specific RNA-processes. Furthermore, SFRS10 facilitates the inclusion of exon 7 into the SMN mRNA by binding to a GA-rich exonic splicing enhancer (ESE) localised in the central part of exon 7. The functional loss of the SMN1 gene causes autosomal recessively inherited spinal muscular atrophy (SMA). SMA is a neurodegenerative disorder caused by a progressive loss of α-motor neurons in the anterior horns of the spinal cord. The phenotypic severity correlates with the copy number of a second gene � SMN2. Due to a translationally silent mutation in exon 7, ~90% of the transcripts generated from SMN2 lack this exon while only 10% of the transcripts are correctly spliced. The correctly spliced full-length transcripts (FL) encode � like the ones generated from SMN1 � functional SMN protein. Overexpression of the splicing factor SFRS10 restores the splicing pattern of the SMN2 in vitro. Due to that effect SFRS10 is a promising candidate for an in vivo modulation of SMN RNA processing. Mice possess only one Smn copy the loss of which results in early embryonic lethality. This phenotype is partly rescued by expression of the human SMN2. These mice reveal an SMA-like phenotype. To analyse the modulating potential of SFRS10 on the SMA phenotype in vivo, an SFRS10 transgenic mouse model had previously been generated in our laboratory in order to finally create an Smn-/-; SMN2+/+; SFRS10 transgenic mouse. The neuronal-specific expression of SFRS10 was investigated in spinal cord of adult mice and embryos. However, transgene expression could not be detected in these mice. Therefore, no further cross-breedings or analyses were performed. Little is known about Sfrs10 protein and its entire spectrum of action. To investigate Sfrs10 function in vivo � also with regard to Smn-splicing � a knockout for the murine orthologue Sfrs10 via the Cre/loxP-system was designed, generated and characterised. Initially, a ubiquitous Sfrs10 deletion was performed and characterised. Even though heterozygous Sfrs10 knockout mice exhibited reduced protein levels, no obvious phenotype in these animals was observed. However, Sfrs10+/- males showed a reversion of Sfrs10 phosphorylation pattern in testis, indicating that regulative mechanisms counteract to overcome the heterozygous loss of Sfrs10. Furthermore, it points towards an essential role of the splicing factor in this tissue. The ubiquitous homozygous loss of Sfrs10 resulted in embryonic lethality around E7.5 and E8.25. Early Sfrs10-/- embryos at E3.5 showed no phenotypical abnormalities as compared to embryos of other genotypes. Homozygous Sfrs10 knockout embryos at E8.5 and E9.5 revealed developmental retardation and signs of resorption. The dramatic impact of Sfrs10-/- loss suggests an essential role of the splicing factor Sfrs10 during early embryogenesis in post implantation stages. This assumption is further supported by the observation of a ubiquitous Sfrs10 expression already at E7. To investigate the influence of Sfrs10 on Smn splicing and on the neuronal phenotypes, a motor neuron specific Sfrs10 deletion was performed via crossbreeds Sfrs10FL/FL-mice with an Hb9-Cre-strain. Mice homozygous for the floxed Sfrs10, carrying the Hb9-transgene showed no phenotypical abnormalities. The motor neuron specific Sfrs10 deletion was shown via immunohistological analysis, whereas it remained unclear whether Sfrs10 was deleted in all motor neurons. Additional analyses of the phenotype of these mice are in progress. The potential of Sfrs10 on Smn splicing was assessed in vitro in murine embryonic fibroblasts (MEFS; Sfrs10FL/FL) using recombinant HTN-Cre in order to delete Sfrs10. Via specific primer combinations a so far not described splicing isoform of Smn � SmnΔ7 � was detected. Expression levels of this isoform were relatively low as compared with FL-Smn transcripts, but Sfrs10 deletion in MEFs resulted in 3-4fold increase in SmnΔ7. Quantification of FL-Smn transcripts and Smn protein levels revealed no changes in Smn concentrations mediated by Sfrs10 deletion, indicating a non-essential role of Sfrs10 in Smn splicing. Taken together, the results of this work indicate an essential role of Sfrs10 during early embryonic development whereas the splicing factor seems to be dispensable in certain tissues and cells such as fibroblasts and motor neurons also with regard to full-length Smn splicing. The generation of a conditionally inducible Sfrs10 knockout mouse model offers various perspectives to analyse Sfrs10 function also with regard to SMN splicing in vivo.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Mende, Ylva Christineylva.mende@uk-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-25357
    Subjects: Life sciences
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Genetik
    Language: German
    Date: 2008
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 22 October 2008
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 03 Dec 2008 16:05:28
    Referee
    NameAcademic Title
    Wirth, BrunhildeProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2535

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