Universität zu Köln

Exploring the therapeutic potential of recombinant AAV vectors in stem cell and transplantation model systems for the treatment of heart diseases

Schuhmann, Natascha (2008) Exploring the therapeutic potential of recombinant AAV vectors in stem cell and transplantation model systems for the treatment of heart diseases. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Herzerkrankungen sind weltweit die Hauptursache für einen vorzeitigen Tod. Sowohl Gentransfer als auch zelluläre Therapien werden derzeit als neue Behandlungsmöglichkeiten für diese Erkrankungen entwickelt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte der AAV-vermittelte Gentransfer von Transgenen ins Herzgewebe von Donororganen, die anschließend transplantiert wurden, etabliert werden. Als Tiermodelle für die heterotopen Herztransplantationen wurden Sprague Dawley Ratten und Deutsche Landrasseschweine gewählt. rAAV2, welcher für diesen Zweck als geeignet beschrieben wurde, wurde intracoronar entweder in das normotherme oder hypotherme Herz appliziert, welches anschließend in eine Empfängerratte transplantiert wurde. Der Gentransfer erfolgte mit einer besseren Effizienz in normotherme Herzen. Trotz des erfolgreichen Transfers und der Nachweisbarkeit von Vektor-DNA in Gewebeproben 28 Tage nach Transplantation konnte jedoch weder Transgen-spezifische mRNA noch Proteinexpression detektiert werden. Zur Bestimmung potentieller Barrieren, welche die rAAV2-vermittelte Transgenexpression in unserem Rattenmodell beeinträchtigen, wurden in vitro Analysen in Rattenaortenendothelzellen durchgeführt. Wir konnten Zelleintritt und intrazelluläres trafficking der viralen Partikel ebenso als inhibierende Faktoren ausschließen wie die Expression vom gewählten CMV Promotor. Die signifikante Erhöhung der Transgenexpression für AAV1 (der effizienteste Serotyp) und AAV2 nach Applikation des Proteasomeninhibitors MG132 deutet auf eine Blockierung in der Vektordegradation hin. Darüberhinaus sind auch indirekte Effekte wie eine erhöhte Ubiquitinierung des Vektorkapsids denkbar, von der man annimmt, dass sie das sogenannte vector uncoating oder die Translokation in den Nucleus erleichtert. Des Weiteren konnte eine geringfügig eingeschränkte Fähigkeit zur Zweitstrangsynthese beobachtet werden. Diese wird benötigt, um das einzelsträngige DNA-Genom herkömmlich verwendeter AAV-Vektoren in einen transkribierbaren Doppelstrang zu verwandeln. Zusammenfassend muss man feststellen, dass sich die analysierten rAAV Serotypen als ungeeignete Gentransfervektoren für Rattenendothelzellen erwiesen haben. Im Gegensatz dazu wurde in primären Rattencardiomyocyten in vitro eine deutlich höhere Transduktionseffizienz erzielt. Um in vivo sowohl Endothelzellen als auch Cardiomyocyten zu transduzieren verwendeten wir die vasoaktive Substanz Histamin in unserem porcinen Transplantationsmodell. Der durch in vitro Versuche als geeignet ermittelte Serotyp 2 wurde unter Verwendung des neuentwickelten in situ Langendorff Reperfusionssystems zusammen mit Histamin in das normotherme Herz appliziert. In beiden Tieren konnte der Nachweis eines erfolgreichen Gentransfers anhand deutlich messbarer Transgen-DNA-Mengen erbracht werden. In einem der beiden Tiere wurde zudem funktionales Protein nachgewiesen. Dieses Schwein hatte zehnmal höhere Vektormengen erhalten. Dieser Vektor kodierte zudem für das Transgen Luciferase und wies eine self-complementary (Pseudo-Doppelstrang) Vektorgenom-Konformation auf. Im Gegensatz dazu wurde das Schwein, das keine Expression zeigte, mit einem Vektor behandelt, der für beta-Galaktosidase in einer Einzelstrang-Vektorgenom-Konformation kodierte. Obwohl weitere Experimente zur Bestimmung des Einflusses der drei Parameter (Vektormenge, Vektorgenom-Konformation und Wahl des Transgens), einzeln oder in Kombination, benötigt werden, konnten wir zeigen, dass ein rAAV2-vermittelter Gentransfer in porcines Herzgewebe im Rahmen eines (Xeno-) Transplantationsansatzes im Prinzip möglich ist. Im zweiten Teil meiner Arbeit wurde ein Protokoll zur effizienten Transduktion humaner CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut etabliert. Derartige Protokolle ermöglichen eine Kombination von Zell- und Gentherapie, welche für ein breites Spektrum an Anwendungen vorteilhaft ist. Vergleiche der Serotypen 2, 3 und 5 ermittelten rAAV2 als den effizientesten Serotyp in Zelleintritt und Transgenexpression. Der Zelleintritt von rAAV2 in CD34+ Zellen war abhängig von Heparansulfatproteoglycan und von alpha-5-beta-1 Integrin. Darüberhinaus ist die Synthese des Zweitstrangs in CD34+ Zellen beeinträchtigt, da nur die Zugabe von Vektoren mit Genomen in der self-complementary Konformation in erfolgreichen Transduktionen resultierte. Die ohnehin schon sehr effiziente Transduktion vorexpandierter Zellen mit rAAV2 mit self-complementary Genomen konnte signifikant durch die Zugabe von all-trans Retinsäure und dem Histon-Deacetylase-Inhibitor Trichostatin A erhöht werden. Darüberhinaus weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass Transduktionen mit rAAV nicht mit der Fähigkeit der CD34+ Zellen zur endothelialen Differenzierung interferieren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass unter Verwendung des etablierten Protokolls CD34+ Zellen effizient mit rAAV2 transduziert werden können und sich rAAV2 somit als geeignetes Vektorsystem zur transienten Modifikation dieser Zellen anbietet.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Heart diseases are the main cause of premature death in the population world-wide. Gene transfer as well as cell-based therapies are currently developed as new treatment options. In the first part of this thesis, AAV-mediated gene transfer to deliver transgenes into heart tissue before transplantation ought to be established. As model system, the Sprague Dawley heterotopic rat model and the German Landrace pig model were chosen. rAAV2, described to be suited for this purpose, was intracoronarily delivered either in the normothermic or hypothermic hearts which were subsequently transplanted into a recipient rat. Gene transfer into normothermic hearts occurred with a better efficiency. However, despite successful delivery and detection of vector DNA in tissue samples 28 d post transplantation, neither transgene-specific mRNA nor protein expression could be detected. To identify potential barriers that impair rAAV2-mediated transgene expression in our rat model, in vitro analyses in rat aortic endothelial cells were performed. We could exclude cell entry, intracellular trafficking of viral particles as well as expression from the chosen CMV promoter as inhibiting factors. The significant enhancement of transgene expression by AAV1 (most efficient serotype) and AAV2 after application of the proteasome inhibitor MG132 indicates a blocking of vector degradation. Moreover, also indirect effects can be imagined like enhanced ubiquitination of the vector capsid, which is believed to facilitate vector uncoating or nuclear translocation of vector genomes. Furthermore, we observed a certain, albeit rather minor, limitation in second-strand synthesis. This step is necessary for the generation of a double-stranded DNA as template for transcription of the commonly used single-stranded DNA genome. In summary, the analyzed rAAV serotypes have been revealed as inappropriate gene transfer vectors in targeting of rat endothelial cells. In contrast, in primary rat cardiomyocytes in vitro a higher transduction efficiency was observed. In order to transduce endothelial cells as well as cardiomyocytes in vivo, we administered the vasoactive substance histamine in our porcine transplantation model. AAV2, which was identified in vitro as the most suited serotype, was applied together with histamine into normothermic hearts using the newly developed in situ Langendorff reperfusion system. Transgene DNA detected in the graft of two transplanted animals displayed successful gene transfer. In one of the two animals functional protein was detected. This pig had received tenfold higher amounts of the vector which displayed a self-complementary vector genome conformation and encoded for the transgene luciferase. In contrast, the animal showing no expression was treated with a vector coding for beta-galactosidase in the single-stranded vector genome conformation. Although further experiments are needed to determine the influence of the three parameters (vector amount, vector genome conformation and choice of transgene) alone or in combination we could show that rAAV2-mediated gene delivery into the porcine heart tissue in a (xeno-) transplantation setting is in principle possible. In the second part of my thesis, a protocol for efficient transduction of human cord blood-derived CD34+ cells was established. Such protocols enable a combination of cell and gene therapy which is advantageous for a wide range of applications. Among the serotypes 2, 3 and 5, rAAV2 was identified as the most efficient serotype in cell entry and in transgene expression. Cell entry of rAAV2 into CD34+ cells was dependent on heparin sulfate proteoglycan and alpha-5-beta-1 integrin. Furthermore, CD34+ cells are impaired in second-strand synthesis as only administration of vectors encoding the transgene in a self-complementary vector conformation resulted in successful transductions. The already high transduction level achieved with rAAV2 using self-complementary vector genomes and pre-expanded cells could be significantly enhanced by addition of all-trans retinoic acid and the histone deacetylase inhibitor Trichostatin A. Furthermore, our results provide strong evidence that transductions by rAAV2 vectors do not interfere with endothelial differentiation potential of CD34+ cells. Thus, an efficient protocol for rAAV2-mediated transduction of CD34+ cells was established revealing that rAAV2 is an appropriate vector system for transient modification of this cell type.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Schuhmann, Nataschankschuhmann@googlemail.com
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-26733
    Subjects: Life sciences
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Genetik
    Language: German
    Date: 2008
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 23 June 2008
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 04 May 2009 12:06:12
    Referee
    NameAcademic Title
    Brüning, JensProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2673

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