Universität zu Köln

Charakterisierung des Yersinia Effektorproteins YopE und der mitochondrialen GTPase Miro in D. discoideum

Vlahou, Georgia (2009) Charakterisierung des Yersinia Effektorproteins YopE und der mitochondrialen GTPase Miro in D. discoideum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Alle humanpathogene Yersinia Spezies teilen sich ein Virulenz-assoziertes TypIII Sekretionssystem, das Yop Effektorproteine in die Wirtszellen translozieren, um die durch Infektionen induzierten Signalantworten entgegenzuwirken und die Phagozytose zu verhindern. In dieser Arbeit wurde D. discoideum als Modellorganismus verwendet, um die Yop Proteinfunktion in zellulären Prozessen zu untersuchen. Die Y. pseudotuberculosis YopE, YopH, YopM und YopJ Proteine wurden de novo in D. discoideum exprimiert und ihre Effekte auf das vegetative Wachstum, der Phagozytose und Aktinpolymerisierung untersucht. Es konnten für YopH, YopJ und YopM keine Defekte aufgezeigt werden, während die Expression von YopE, das ein GAP für Rho GTPasen ist und zu zerstörten Aktinfilamenten in Säugerzellen führt, in einer reduzierten Wachstumrate in Schüttelkultur und auf Bakterienrasen resultiert. Des Weiteren assoziiert GFP-markiertes YopE an intrazellulären Membranen, im Speziellen dem Golgiapparat und weniger auffallend am ER. YopE-exprimierende Zellen wiesen weniger F-Aktin auf, eine veränderte Aktinverteilung und zeigten eine beeinträchtigte Aktinpolymerisierungs¬antwort durch cAMP Stimulierung, obwohl die Chemotaxis und andere Aktin-vermittelte Prozesse wie die Zytokinese nicht beeinflusst wurden. Eine starke GFP-YopE Expression resultierte in einer verminderten Phagozytose. Weiterhin führte eine Expression von GFP-YopE in den Rho GTPasen RacH und Rac1 Überexprimierern zu einer Inhibierung ihrer Funktion in D. discoideum und bestätigten somit die Funktion von YopE als GAP Protein. Die Proteine der Miro Familie bestehen aus einem Tandem von zwei GTPase Domänen, die eine EF-Hände Domäne flankieren und eine C-terminale Transmembrandomäne. Die N-terminale GTPase Domäne hat Sequenz¬ähnlichkeiten zu anderen Proteinen der Ras Superfamilie, während die Funktion der zweiten GTPase bisher unbekannt ist. Die Miro Familie ist in allen Eukaryonten vorhanden, was auf eine konservierte Funktion durch alle Stämme hindurch schließen lässt. Mit D. discoideum als Modellorganismus wurden die biochemischen und funktionellen Aspekte der Rolle von Miro untersucht. Ein Miro Gen (gemA) wurde bisher in D. discoideum identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, das Miro Proteine durch ihre Transmembrandomäne an der äusseren mitochondrialen Membran verankert werden. Durch einen generierten Knockoutstamm war es möglich, Aktinzytoskelett-spezifische Prozesse und die mitochondriale Funktion von Miro zu untersuchen. Die Analysen von gemA defizienten Zellen zeigten signifikante Defekte im Sauerstoff- und Glukoseverbrauch sowie reduzierte ATP Konzentrationen, die durch einen möglichen Energiemangel oder durch eine reduzierte mitochondriale Masse verursacht wurden. Des Weiteren wurde eine Assoziation des Miro mit dem Mikrotubulinetzwerk beobachtet; dies könnte auf eine Rolle des Miro im Transport der Mitochondrien entlang der Mikrotubuli vermuten lassen. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um potententielle Interaktionspartner zu identifizieren und die Rolle des Miro im Zusammenhang mit dem Mitochondrientransport in D. discoideum zu bekräftigen.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    All human pathogenic Yersinia species share a virulence-associated type III secretion system that translocates Yop effector proteins into host cells to counteract infection-induced signaling responses and prevent phagocytosis. In this study D. discoideum was utilized as model organism for analyzing Yop protein function on cellular processes. The Y. pseudotuberculosis YopE, YopH, YopM and YopJ proteins were expressed de novo within D. discoideum and their effect on vegetative growth, phagocytosis, and actin polymerization was analyzed. No severe effect was observed for YopH, YopJ, YopM, but expression of YopE, which is a GAP for Rho GTPases that leads to disruption of actin filaments in mammalian cells, was shown to be harmful for D. discoideum and resulted in a strong growth inhibition in axenic medium and on bacterial lawn. Furthermore, we found that GFP-labeled YopE associates with intracellular membranes, particularly with the Golgi apparatus and less visibly with the ER. YopE expressing cells had less F-actin and showed an impaired actin polymerization response upon cAMP stimulation, although chemotaxis and other actin-mediated processes such as cytokinesis were apparently unaffected. Strong GFP-YopE expression was shown to result in a reduced phagocytosis. Furthermore, expression of GFP-YopE in strains that overexpress Rho GTPases RacH and Rac1 led to strong inhibition of their functions in D. discoideum and confirmed the GAP function of YopE. Proteins of the Miro family consist of a tandem of two GTPase domains, which is separated by a linker region containing two calcium-binding EF hand motifs. The N-terminal GTPase domain has sequence similarity with proteins of the Ras superfamily, whereas the second GTPase domain is of unknown function. The Miro family is represented in all eukaryotes, suggestive of a conserved function throughout the phyla. Using D. discoideum as a model organism research on the biochemical and functional aspects was possible to uncover the role of Miro. One Miro gene (gemA) has been identified in D. discoideum. Miro proteins are anchored to the outer mitochondrial membrane by virtue of a short transmembrane region as shown in this study for the D. discoideum homolog too. Actin cytoskeleton specific processes as well as the mitochondrial function of Miro were studied by using a generated knockout construct. Investigations of gemA deficient cells revealed significant defects in oxygen and glucose consumption as well as less ATP levels, which might be due to a deficiency of energy or to the noticed reduced mitochondrial mass. Furthermore an association of Miro with the microtubule network was observed, which might suggest a role for Miro in the transport of mitochondria along the microtubules. Further analyses are necessary for the identification of potential interaction partners to underscore a role for Miro in the trafficking processes of D. discoideum.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Vlahou, Georgiagvlahou@uni-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-27253
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Dictyostelium, GTPasen, Yersinia, YopE, MiroGerman
    Dictyostelium, GTPases, Yersinia, YopE, MiroEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Biochemie I
    Language: German
    Date: 2009
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 08 February 2009
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 15 Jun 2009 11:48:25
    Referee
    NameAcademic Title
    Noegel, Angelika A.Prof. Dr
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2725

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