Universität zu Köln

Tiermodelle der Molybdän-Cofaktor-Defizienz und ihre Therapie

Hahnewald, Rita (2009) Tiermodelle der Molybdän-Cofaktor-Defizienz und ihre Therapie. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Die Molybdän-Cofaktor (MoCo) -Defizienz ist eine autosomal rezessiv vererbte Krankheit. An der MoCo-Biosynthese beim Menschen sind verschiedene Enzyme beteiligt, die von den Genen MOCS1, MOCS2, MOCS3 und GEPH kodiert werden. Mutationen im MoCo-Biosyntheseweg führen zum Verlust der MoCo-abhängigen Enzyme Sulfitoxidase, Xanthindehydrogenase und Aldehydoxidase. Der Verlust dieser Enzymaktivitäten hat hauptsächlich schwere neuronale Schäden zur Folge und die meisten MoCo-defizienten Patienten sterben im frühen Kindesalter. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem Mocs1-Knockout-Modell für die MoCo-Defizienz Typ A mit Mutationen im MOCS1-Gen, um bisher bekannte Behandlungsmöglichkeiten zu verbessern bzw. neue Therapiemöglichkeiten zu finden. In den vergangen Jahren konnte eine Substitutionstherapie mit zyklischem Pyranopterinmonophosphat (cPMP), dem ersten Zwischenprodukt der MoCo-Biosynthese, etabliert werden. Mocs1-defiziente Mäuse sterben spätestens 12 d nach der Geburt mit einer durchschnittlichen Lebensdauer von 7.5 d. Die intrahepatische cPMP-Behandlung konnte den Phänotyp der MoCo-Defizienz erheblich verbessern, so dass die behandelten Mäuse ein durchschnittliches Alter von 91.8 d erreichten und fertil waren. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten cPMP-Dosis-Bestimmungen führten zu einer weiteren Verlängerung der Lebensdauer der behandelten Mäuse auf durchschnittlich 160 d. Außerdem wurde die orale Gabe als eine neue Applikationsform des cPMPs untersucht. Eine Alternative zur cPMP-Substitutionstherapie eröffnete sich mit der Identifizierung und biochemischen Charakterisierung der pflanzlichen Sulfitoxidase (PSO) aus Arabidopsis thaliana, deren Fähigkeit die murine MoCo-Biosynthese zu restaurieren im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Zwar wurde eine Verlängerung der Lebensdauer erreicht, jedoch traten schwere Nebenwirkungen auf, die vermutlich auf die Bildung von H2O2, ein Nebenprodukt der Detoxifizierung der PSO, zurückzuführen ist. Sie hatte den Tod der behandelten Mäuse zur Folge. Auch eine Injektion von embryonalen Hepatozyten in das Lebergewebe Mocs1-defizienter Mäuse konnte den Phänotyp der MoCo-Defizienz nicht verbessern. Des Weiteren wurde die somatische Gentherapie für die Behandlung der MoCo-Defizienz Typ A in Betracht gezogen. Einerseits wurde untersucht, inwieweit die Verwendung von Atellocollagen als Trägermaterial von Plasmid-DNA sich auf die Transfektionsrate im Rahmen des nichtviralen Gentransfers auswirkt. Anderseits sollten virale Vektoren genutzt werden, um das intakte MOCS1-Gen in Mocs1-defiziente Mäuse einzubringen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Langzeitexpression verschiedener Expressionskassetten nachgewiesen werden, die mit Hilfe eines rekombinanten Adeno-assoziierten Vektor (rAAV) des chimären Serotyp 1/2 eingebracht wurden. Neben dem Vergleich verschiedener Applikationswege und Injektionszeitpunkte wurde auch die notwendige Dosis für die Aufhebung des Phänotyps der MoCo-Defizienz bestimmt. Außerdem wurde die Wirkung von zwei- und dreifachen Injektionen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt von Mäusen untersucht. Dabei wurde ein kurzes neonatales Zeitfenster gezeigt, in dem das Immunsystem nicht auf den eingebrachten Vektor reagierte. Die Exposition mit dem rAAV-Capsid innerhalb dieses Fensters erlaubte die transgene Expression nach einer erneuten rAAV-Transduktion zu einem späteren Zeitpunkt. Dreifach-Injektionen des rAAV zeigten jedoch, dass außerhalb dieses Zeitfensters nicht mehr als eine Applikation des rAAVs möglich war, was gegen eine Ausbildung einer Immuntoleranz gegenüber dem viralen Capsid spricht. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Molybdän-Cofaktor-Defizienz Typ B. Im Falle des humanen MOCS2-Gens wurde eine neue Spleißform beschrieben, welches ein bis dahin unbeschriebenes Exon enthält. Der experimentelle Nachweis der Spleißform III im Rahmen dieser Arbeit zeigte, dass MOCS2B nicht durch leaky scanning translatiert wird, sondern dass durch das neue Transkript das MOCS2A-Startcodon umgangen und die Translation beim MOCS2B-Startcodon initiiert wird. Studien an Patientenfibroblasten mit Mutationen in diesem Abschnitt der MoCo-Biosynthese zeigten, dass MOCS2B nur zusammen mit MOCS2A stabil vorliegen kann. Weiterhin wurden die genomische Struktur des murinen Mocs2-Gens und dessen Transkripte untersucht. Diese Analysen gaben neue Hinweise auf die Bildung der Untereinheiten der Molybdopterinsynthase.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Molybdenum cofactor (MoCo) deficiency is an autosomal recessive inherited disease. The biosynthetic pathway leading to MoCo requires several enzymes encoded by the genes MOCS1, MOCS2, MOCS3, and GEPH. Mutations in any of these genes abolish formation of active MoCo, leading to the pleiotropic loss of all MoCo dependent enzymes such as sulfite oxidase, xanthine dehydrogenase as well as aldehyde oxidase. Affected patients display a progressive neuronal damage, which leads in most cases to death before adolescence. The first part of this thesis was engaged with a murine model for MoCo deficiency type A with mutations in the MOCS1 gene to improve established treatment regimen or to find new therapies. In the past years a substitution therapy with cyclic pyranopterin monophosphat (cPMP), the first intermediate of MoCo biosynthesis, was established. Mocs1-deficient mice die within the first 12 days after birth, with an average life span of 7.5 d. Intrahepatic cPMP injections ameliorated the phenotype of MoCo-deficiency. The mice reached adulthood und were fertile. In this work the cPMP application rate was increased to improve the longevity of treated mice. Additionally, a new application in form of oral administration was investigated. An alternative substitution became possible with the identification and biochemical characterization of the plant sulfite oxidase (PSO) from Arabidopsis thaliana. Its ability to rescue the phenotype of MoCo deficiency was investigated in this work. An elongation of life span was achieved. But serious side effects of this treatment resulting from the formation of H2O2, which is a byproduct of the PSO mediated detoxification, led eventually to the death of the treated mice. The delivery of embryonic hepatocytes in the liver of Mocs1-deficient mice could also not improve the phenotype of the MoCo deficiency. Furthermore, the possibilities of somatic gene therapy for MoCo deficiency were explored. First, nonviral gene transfer of plasmid DNA coated with a polymer were used. Second, viral vectors were utilized to deliver the MOCS1 gene into Mocs1-deficient mice. In this work the dosage of recombinant AAV necessary to rescue the lethal deficiency phenotype was determined. Also the long-term expression of different expression cassettes delivered in a chimeric AAV capsid of serotype 1/2 was demonstrated and different routes of application were compared. In addition the effect of double and triple injections at different time points after birth was studied and a short neonatal window for non-response of the immune system was found. Exposition with rAAV capsids within this window allowed transgene expression after a second rAAV transduction at a later time point. However, exposition within this window does not trigger immunotolerance to the viral capsid, which hampers the repeated rAAV-mediated gene transfer outside this tolerant window. The second part of this thesis was engaged with the molybdenum cofactor deficiency type B. In case of the human MOCS2 gene a new splice form containing an alternate first exon was confirmed, which was undescribed until now. The experimental verification of this splice form disproved leaky scanning as the mode of MOCS2B translation. This novel transcript circumvents the MOCS2A start codon and renders the MOCS2B start codon as target for the scanning mechanism of translation initiation. In addition, studies with fibroblasts from a patient with a mutation in this step of MoCo biosynthesis showed that MOCS2B only stable exists in the presence of MOCS2A. Furthermore, the genomic structure of the murine Mocs2 gene and its corresponding transcripts were examined. These analyses gave new insights in the formation of the molybdopterin synthase subunits.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Hahnewald, RitaR.Hahnewald@gmx.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-29502
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Molybdän-Cofaktor-Defizienz, cPMP, somatische Gentherapie, AAV, ReapplikationGerman
    molybdenum cofactor deficiency, cPMP, somatic gene therapy, AAV, reapplicationEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Biochemie
    Language: German
    Date: 2009
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 18 November 2009
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 25 Jan 2010 13:05:46
    Referee
    NameAcademic Title
    Schwarz, GünterProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2950

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