Universität zu Köln

Identification of novel regulators of COP1-controlled morphogenesis in Arabidopsis thaliana

Schrader, Andrea (2011) Identification of novel regulators of COP1-controlled morphogenesis in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    In Arabidopsis thaliana, COP1 is an essential element of light signal transduction acting downstream of photoreceptors and upstream of light-regulated gene expression. The COP1 protein acts as part of an E3 ligase complex to suppress photomorphogenic gene expression by ubiquitin-dependent degradation of light-regulated transcription factors. In dark-grown seedlings, the repression of photomorphogenesis involves the inhibition of hypocotyl growth, anthocyanin accumulation, expression of light-responsive genes, differentiation of etioplasts and prevention of apical hook formation. Loss of COP1 function leads to a pleiotropic phenotype comprising of constitutive photomorphogenesis in the dark and resulting in a post-germination growth arrest. The vegetative growth arrest of cop1 mutants, a possible role of COP1 concerning the cell cycle and the molecular factors regulating the nucleocytoplasmic partitioning of COP1 exemplify aspects of COP1 function and regulation that are poorly understood until now. This work aimed at the identification of regulators of COP1-controlled morphogenesis to contribute to a better dissection of the latter. In yeast two hybrid screenings (YTH) 32 new interaction candidates for COP1 were identified and a purpose oriented selection was performed. In order to select a putative regulator of COP1, all COP1 and additional DET1 interaction candidates were integrated in a network of published interactors. Out of the network and the screening results PAP2 (PRODUCTION OF ANTHOCYAN PIGMENT) was identified and selected as a putative new target. MID (= MIDGET) was selected as a putative new regulator of COP1, respectively. MID is a part of the topoisomerasis VI (TOPOVI) complex that is needed to complete more than two endocycles in plant cells. This work provides evidence for a physical interaction of MID and PAP2 with COP1. In addition, a new YTH-based domain mapping method was developed and used to identify so far unknown domains of PAP2 for the interaction with COP1 and for COP1 for the interaction with MID and TOPOVI components. Similar to cop1, mid and topoisomerase VI mutants exhibited all aspects of constitutive pohotomorphogenesis in the dark. Double mutant analysis indicated that MID is not a target of COP1. In infiltrated leaves of Nicotiana benthamina, the presence of MID is needed for COP1 to form a high number of subnuclear foci. MID and the TOPOVI were shown to be essential regulators of COP1 function probably by stabilising COP1 and thereby adding a new cell-cycle related factor to the regulation of COP1 activity. The functional relevance of the MID-COP1 interaction was proven by analysing phenotypes of the single mutants and genetic interaction. First evidence positioning MID in a SPA1 and phyA-dependent complex or pathway were obtained by the verification of the SPA1-MID interaction via BiFC, co-purification of MID with phyA and analysis of the protein stability of MID depending on light quality. Finally it was found that mid and topoVI mutants phenocopy det1-1 mutants and overexpressor lines of the C-termini of CRY1 and CRY2, possibly providing a new link to crosstalk between red and blue light mediated signaling.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    COP1 ist ein essentielles Element, ein Regulator, in der Lichtsignaltransduktion in Arabidopsis thaliana. Dieser Regulator ist auf einer Ebene aktiv, die sich „unterhalb“ der Photorezeptoren und „oberhalb“ der Genexpression befindet. Das COP1 Protein ist Teil eines E3 Ligase Komplexes, der photomorphogenetische, lichtabhängige Genexpression durch Ubiquitin-abhängigen Abbau lichtregulierter Transkriptionsfaktoren unterdrückt. Bei im Dunkeln gewachsenen Keimlingen umfasst die Unterdrückung der Photomorphogenese die Hemmung des Hypokotylwachstums, Anthocyan- Ansammlung, Expression von Licht-regulierten Genen, Differenzierung von Etioplasten und Verhinderung der Bildung eines apikalen Hakens. Der Verlust der COP1-Funktion führt zu pleiotropischen Effekten, bestehend aus konstitutiver Photomorphogenese im Dunklen und resultiert in einem Wachstumsdefekt nach der Keimung. Beispiele für Aspekte der COP1 Funktion und Regulation sind der vegetative Wachstumsstopp von cop1 Mutanten, eine mögliche Rolle von COP1 bzgl. des Zellzyklus und die molekularen Faktoren, die den Kern-Zytoplasma Transport von COP1 regulieren. Diese sind bisher schlecht verstanden. Diese Arbeit zielte auf die Identifikation von Regulatoren COP1-kontrollierter Morphogenese, um ein besseres Verständnis dieser Effekte zu gewinnen. Über Hefe - Zwei - Hybrid Screenings wurden 32 neue Interaktionskandidaten für COP1 identifiziert und eine zweckorientierte Selektion durchgeführt. Alle Interaktionskandidaten für COP1 und zusätzlich für DET1 wurden in ein Netzwerk aus publizierten Interaktionen integriert, um neue putative Regulatoren von COP1 zu selektieren. Mit PAP2 (PRODUCTION OF ANTHOCYAN PIGMENT) wurde ein putatives Ziel und MID (MIDGET) ein putativer, neuer Regulator von COP1 erfolgreich identifiziert und selektiert. MID ist Teil des Topoisomerase VI–Komplexes (TOPOVI), der benötigt wird, um mehr als zwei Endocyclen in Pflanzenzellen zu beenden. Diese Arbeit weist eine direkte Interaktion von MID und PAP2 mit COP1 nach. Zusätzlich wurde eine neue Hefe-Zwei-Hybrid basierende Domänen-Kartierungs-Methode entwickelt und genutzt, um bisher unbekannte Domänen von PAP2 für die Interaktion mit COP1 und von COP1 für die Interaktion mit MID und TOPOVI-Bestandteilen zu identifizieren. Ähnlich wie cop1 weisen mid und topoVI Mutanten im Dunklen alle Aspekte konstitutiver Photomorphogenese auf. Doppelmutantenanalysen weisen darauf hin, dass MID kein Ziel von COP1 ist. In infiltrierten Blättern von Nicotiana benthamiana war die Anwesenheit von MID nötig für COP1, um eine hohe Anzahl an subnukleären Foki zu bilden. Für MID und die TOPOVI wurde gezeigt, dass sie möglicherweise durch Stabilisation essentielle Regulatoren der COP1 Funktion sind. Die funktionale Relevanz der MIDCOP1- Interaktion konnte durch Analyse von Einzelmutanten und genetische Interaktion bewiesen werden. Erste Nachweise, die MID in einen SPA1 / phyA abhängigen Komplex oder pathway stellen, wurden durch Verifikation der SPA1-MID-Interaktion per BiFC, Ko-purifizierung von MID mit phyA und Analyse der Proteinstabilität von MID in Abhängigkeit von der Lichtqualität erbracht. Schließlich wurde festgestellt, dass mid und topoVI Mutanten eine Kopie des Phänotyps von det1-1 Mutanten und Überexpressions-Linien der C-Termini von CRY1 und CRY2 sind. Damit ergeben sich neue Hinweise auf eine mögliche Verbindung zwischen Rotlicht- und Blaulicht-abhängige Regulationsmechanismen.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Schrader, AndreaAndrea.Schrader@uni-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-42219
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    COP1English
    MIDGETEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Botanisches Institut
    Language: English
    Date: May 2011
    Date Type: Publication
    Date of oral exam: 09 June 2010
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 22 Jun 2011 17:17:29
    Referee
    NameAcademic Title
    Uhrig, Joachim F.PD Dr.
    Höcker, UteProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4221

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