Universität zu Köln

Retrotransposon Tto1: functional analysis and engineering for insertional mutagenesis

Tramontano, Andrea and Tramontano, Andrea and Tramontano, Andrea (2011) Retrotransposon Tto1: functional analysis and engineering for insertional mutagenesis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Retrotransposons are genomic parasites activated by stress conditions that can be seriously detrimental for their host. In this work I demonstrate that Tto1, a typical plant LTR retrotransposon with insertion preference into genes can be turned into a synthetic molecular tool for gene tagging in plants and can be used to predict models for its replication steps. Although retrotransposons have been already used in plant mutagenesis, such application always required establishing protocols for tissue cultures and regeneration in vitro. Here, I show that sequence engineering of Tto1 provides the possibility to obtain transposition in vivo, with a simple screening method based on PCR and with the advantage to skip all in vitro manipulations. An artificial -estradiol inducible promoter has been used to obtain transposition “on demand” in Arabidopsis plants, which generates stable unlinked insertions that follow mendelian segregation in the progeny. Comparing serial deletions of 3’ LTR of the engineered inducible Tto1 (iTto1), I have mapped its two natural terminators and identified the “minimal” R (redundant) region required to achieve the complete reverse transcription of the genomic mRNA into a new cDNA copy. Interestingly, the transcripts ending at the major “early” terminator cannot support reverse transcription, suggesting a mechanism of natural control on the expression. Transcripts with a more extended termination point contain 100 essential nucleotides that define the active nucleus of the R region. This sequence promotes the formation of a stable hairpin structure that “kisses” a complementary identical hairpin on the cDNA and determines the formation of the characteristic cDNA/mRNA heteroduplex. Since the LTR is a repeated sequence the definition of a minimal redundant region has also the important implication to reduce the only possible target for sequence-based gene silencing, which should lead to an increase of the mutagenic efficiency of iTto1. Additional investigations have been carried out in attempt to identify points of improvement of iTto1 performances. By sequence alignment I identified different versions of the integrase that might have influence on insertion efficiency. Furthermore I tested the pOp6/LhGR-N system that will provide higher expression levels in different host plants. The final goal of my work is to extend the application of iTto1 to crop mutagenesis, therefore a big part of my work has been spent to develop Tto1 constructs with activity in barley. Transgenic plants have been obtained, however the constructs still need further experimentation.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Retrotransposons sind genomische Parasiten, welche unter Stressbedingungen aktiv werden und dadurch den Wirt schädigen können. Tto1 ist ein typisches pflanzliches Retrotransposon und insertiert bevorzugt in Gene. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Tto1 in ein Werkzeug für Insertionsmutagenese verwandelt werden kann. Retrotransposons sind bereits zur Mutagenese von Pflanzen verwendet worden, doch verlangt dies üblicherweise Protokolle zur Gewebekultur und Regeneration. Wir konnten zeigen, dass Änderungen an Tto1 es ermöglichen, ohne Gewebekultur-Schritte in vivo Transpositionsereignisse herbeizuführen, welche mit einer einfachen PCR-basierenden Screening-Methode detektiert werden können. Ein -Östradiol-induzierbarer Promotor wurde verwendet, um in Arabidopsis Pflanzen Transposition zu induzieren. Diese stabilen Neu-Insertionen werden nach Mendel´schen Gesetzen weiter vererbt. Das veränderte Element wurde auch zur Analyse des Replikationszyklus verwendet. Es wurden serielle Deletionen in der langen terminalen Sequenz-wiederholung am 3´ Ende hergestellt. Zwei Regionen der Translationstermination wurden kartiert und eine minimale redundante Region definiert, welche für korrekte reverse Transkription notwendig ist. Transkripte, die in der ersten Terminationsregion enden, können nicht revers transkribiert werden, während die längeren Transkripte eine Kernegion von 100 Basenpaaren enthalten, welche für die reverse Transkription essentiell ist. Die Kernregion enthält eine stabile Haarnadelstruktur, die mit einer kompementären Haarnadelstruktur in der entstehenden komplementären DNA Basenpaarungen ausbilden kann, um eine DNA-RNA Heteroduplex Struktur auszubilden. Kenntnis der minimalen redundanten Region kann dazu verwendet werden, die Sequenzwiederholungen an den Enden von Tto1 zu verkürzen und so die Basis für Genstillegungen, welche oft von Sequenzwiederholungen induziert werden, zu verkleinern. Eine Reihe von Untersuchungen wurden durchgefüht, um die Transpositions-Effizienz von Tto1 zu erhöhen. Durch Sequenzvergleiche wurden verschiedene Versionen des Retrotransposon-Enzyms Integrase identifiziert, welche Einfluss auf die Integrations-Effizienz haben sollten. Es wurde auch das pOp6/LhGR-N Induktionssystem getestet, welches höhere Expression von Tto1 in Wirtspflanzen erlauben sollte. Ein weiteres Ziel der Arbeit war es, Tto1 für Mutagenese in der Kulturpflanze Gerste heranzuziehen. Vektorkonstrukte für Gerste wurden hergestellt und zur Transformation von Gerste herangezogen, doch stellte sich heraus, dass die Konstrukte weiterer Verbesserungen bedürfen.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Tramontano, Andreaandrea.tramontano@univie.ac.at
    Tramontano, Andreatramonta@mpipz.mpg.de
    Tramontano, Andreasunset.andrea@googlemail.com
    Contributors:
    ContributionNameEmail
    Thesis advisorBachmair, Andreasandreas.bachmair@univie.ac.at
    Thesis advisorBoehmdorfer, Gudrungudrunb@umich.edu
    CollaboratorBoehmdorfer, Gudrungudrunb@umich.edu
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-46153
    Journal or Publication Title: Virology - Deletion analysis of the 3′ long terminal repeat sequence of plant retrotransposon Tto1 identifies 125 base pairs redundancy as sufficient for first strand transfer
    Publisher: Elsevier
    Volume: 412
    Number: 1
    Subjects: Natural sciences and mathematics
    Agriculture
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    First strand transfer; Long terminal repeat; Redundancy region; Retrotransposon; Tto1English
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > MPI für Züchtungsforschung
    Language: English
    Date: 21 February 2011
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 05 April 2011
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 23 Apr 2012 15:24:06
    Referee
    NameAcademic Title
    Coupland, GeorgeProf. Dr.
    Huelskamp, MartinProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4615

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