Universität zu Köln

Wagner, Stephan (2013). Analysing Novel Structures of Protein Complexes Requiring the Central Plant Immune Regulator EDS1. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Plants as sessile organisms are constantly attacked by pathogens and have evolved a complex immune system to cope with this challenge. The first inducible layer of plant immunity recognises pathogens outside each plant cell and activates a resistance response that is usually sufficient to halt pathogen infection. Many pathogens, however, produce effector molecules that suppress these defences and thus allow successful invasion of the plant. A second layer of plant immunity relies on the specific recognition of these effectors through intracellular immune receptors, the so-called R (resistance) proteins. Effector recognition triggers a fast and strong immune response that is often associated with localised cell death at the site of infection. To prevent spreading cell death and to reduce the cellular costs of an activated immune system, these activities have to be tightly regulated. The nucleo-cytoplasmic protein EDS1, which exists in all higher plant species, has emerged as a central regulator downstream of effector recognition. EDS1 physically interacts with two sequence-related proteins, PAD4 and SAG101, that share an organisation into an N-terminal domain that is related to eukaryotic lipases and a C-terminal domain that has no obvious sequence homologs. The EDS1 protein family, as defined by this organisation, is involved in multiple plant stress signalling pathways. While recent studies have helped to genetically position EDS1, PAD4 and SAG101, their biochemical mode of action remained elusive. To gain mechanistic insights into their functions, the structures of EDS1-containing complexes should be elucidated by means of X-ray crystallography. This thesis describes the preparation of recombinant proteins, their characterisation and the de novo structure solution of a functional complex between EDS1 and SAG101. I found that EDS1, despite being closely related to eukaryotic lipases at sequence and structure level, does not utilise conserved lipase features to bind or process a (lipid-derived) signalling molecule in central immune pathways of the model plant Arabidopsis. The lipase-like half of the protein is rather optimised for protein-protein interactions within the EDS1 family. The interactions between EDS1 and SAG101 were characterised in vitro and in vivo and used to infer a homology model of PAD4. EDS1, PAD4 and SAG101 loss-of-interaction variants were proposed on the basis of this structural information and could be verified experimentally. These will help to further discriminate between the functions of single components and protein complexes within EDS1-dependent pathways. While interactions within the EDS1 protein family are largely driven by the lipase-like half, the C-terminal EP domain is sequentially and structurally unique but reveals a distant relation to proteins that exist in multi-protein complexes. This domain potentially acts as a binding platform for proteins outside the EDS1 family and could gain importance as the number of experimentally characterised EDS1 interactors is constantly growing.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Als sessile Organismen sind Pflanzen ständigen Attacken durch Pathogene ausgesetzt und haben als Antwort darauf ein komplexes Immunsystem entwickelt. Die erste Ebene pflanzlicher Immunität erkennt Pathogene noch außerhalb der Zelle und aktiviert Resistenzmechanismen die in der Regel ausreichen, einen Befall durch das Pathogen zu verhindern. Eine Vielzahl von Pathogenen synthetisiert allerdings sogenannte Effektormoleküle, die diese Resistenzmechanismen aushebeln und so den Befall der Pflanze ermöglichen. Eine zweite Ebene des pflanzlichen Immunsystems erkennt solche Effektoren mittels intrazellulärer Immunrezeptoren, den sogenannten R (Resistenz) Proteinen. Erkennung des Effektors führt zu einer Immunantwort, die häufig mit lokalem Zelltod am Ort der Infektion assoziiert ist und deshalb strikt reguliert werden muss. Das nukleo-zytoplasmatische Protein EDS1, das ist allen höheren Pflanzen existiert, übernimmt eine zentrale regulatorische Rolle nach Effektor-Erkennung. EDS1 wechselwirkt mit den sequenzverwandten Proteinen PAD4 und SAG101, die, ebenso wie EDS1, in eine N-terminale Domäne mit Ähnlichkeit zu eukaryotischen Lipasen und eine C-terminale Domäne organisiert sind, für die sich keine offensichtlichen Sequenzhomologe finden. Die EDS1 Proteinfamilie ist durch diese Organisation charakterisiert und spielt eine zentrale Rolle in unterschiedlichsten Stress-Signalwegen der Pflanze. Während genetische Analysen geholfen haben, die EDS1 Familie in diese Signalwege einzuordnen, blieb ihre biochemische Funktion unbekannt. Um mechanistische Einblicke in ihre Funktion zu erlangen, sollten die Strukturen von EDS1-assoziierten Proteinkomplexen mittels Röntgenstrukturanalyse gelöst werden. In dieser Arbeitist die Präparation von rekombinanten Proteinen, deren Charakterisierung und eine neuartige Struktur des funktionalen Komplexes aus EDS1 und SAG101 beschrieben. Ich konnte zeigen, dass EDS1 trotz seiner strukturellen Verwandtschaft zu Lipasen in zentralen Immunsignalwegen der Modellpflanze Arabidopsis weder ein (lipidähnliches) Kleinmolekül bindet noch umsetzt. Die lipase-ähnliche Domäne ist vielmehr optimiert, um Protein-Protein Wechselwirkungen innerhalb der EDS1 Familie zu vermitteln. Die Wechselwirkungen zwischen EDS1 und SAG101 wurden in vitro und in vivo charakterisiert und dazu benutzt, ein Homologie-Modell von PAD4 zu erstellen. Interaktionsdefiziente Varianten von EDS1, PAD4 und SAG101 wurden auf Basis dieser Strukturen vorgeschlagen und experimentell validiert. Diese stellen wertvolle Werkzeuge dar, um zwischen den biologischen Funktionen von einzelnen Proteinen und Protein-Komplexen innerhalb EDS1-abhängiger Signalwege zu unterscheiden. Während die Interaktionen innerhalb der EDS1 Proteinfamilie vor allem von der lipase-ähnlichen Domäne bestimmt werden, scheint die C-terminale EP Domäne auf Sequenz- und Strukturebene einzigartig zu sein. Eine entfernte strukturelle Verwandtschaft zu Proteinen aus Multiprotein-Komplexen bedeutet möglicherweise, dass diese Domäne Interaktionen außerhalb der EDS1-Familie vermittelt. Dieser Aspekt könnte in Zukunft an Bedeutung gewinnen da zunehmend mehr EDS1 Interaktoren charakterisiert werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Wagner, Stephan UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-53412
Date:	25 April 2013
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language plant innate immunity; effector triggered immunity; enhanced disease susceptibility1 (EDS1); senescence associated gene101 (SAG101); phytoalexin deficient4 (PAD4); crystal structure determination of an EDS1/SAG101 heterodimeric complex German
Date of oral exam:	14 May 2013
Referee:	Name Academic Title Niefind, Karsten Prof. Dr. Hofmann, Kay Prof. Dr. Nürnberger, Thorsten Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5341