Universität zu Köln

Mechanistic studies on the regulation of Ran-function by post-translational lysine-acetylation

Boor, Susanne de (2015) Mechanistic studies on the regulation of Ran-function by post-translational lysine-acetylation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    The small GTP-binding protein Ran regulates fundamental cellular processes such as nucleocytoplasmic transport, nuclear envelope formation and mitotic spindle assembly. The two nucleotide states of Ran, GTP- and GDP-bound, are characterized by distinct conformations of two regulatory regions (switch I and switch II) which determine effector binding. The interconversion of these two states is facilitated by regulatory proteins (RanGAP, RCC1). The differential localization of these proteins leads to the formation of a Ran*GDP/GTP gradient. A mass-spectrometrical screen of the acetylome of human cell lines in 2009 identified five acetylation sites in Ran, which were confirmed by subsequent screens in different organisms. The aim of this thesis was to study the impact of Ran-acetylation on Ran-function. Furthermore, the abundance and regulation of this post-translational modification was investigated to judge the physiological relevance of Ran-acetylation. In this study, recombinant Ran was site-specifically acetylated at lysines 37, 60, 71, 99 and 159 using the genetic-code expansion concept in E.coli. The proteins were purified and characterized regarding their intrinsic properties and the interaction with the nucleotide exchange factor RCC1, the major import receptor Importin-ß and the Ran-shuttling protein NTF2 (nuclear transport factor 2). The comprehensive in vitro characterization revealed that acetylation of single lysines impacts on RCC1-interaction and -catalysis, Ran-localization and import-complex formation. Ran acetylated at lysines 37, 99 or 159 exhibits a higher binding affinity for Importin-ß. Acetylation of lysine 71 (in switch II) has a dominant negative effect on RCC1 analogous to the T24N-mutant of Ran. Furthermore, it abolishes NTF2-interaction, which consequently affects Ran-localization and the formation of the Ran-gradient. Moreover, Ran acetylated at lysine 99 resembles a loss-of-function mutant regarding RCC1, lowering affinity and nucleotide exchange rates. Regulatory enzymes for Ran-specific de-/acetylation were identified in vitro and in vivo. Sirt1, -2 and -3 are deacetylating enzymes for lysine 37 of Ran, whereas lysine 71 is specifically deacetylated by Sirt2. The enzymatic acetylation of Ran by the acetyltransferases Tip60, p300 and CBP was shown by immunoblotting and mass-spectrometrical analysis and lysines 37, 134 and 142 were identified as the major acetyl-acceptors of Ran. Taken together, these results suggest a strong regulatory potential of Ran-acetylation depending on the cellular context.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Das kleine G-Protein Ran ist an elementaren zellulären Prozessen wie dem nukleozytoplasmatischen Transport sowie dem Aufbau der Kernhülle und der mitotischen Spindeln beteiligt. Die zwei nukleotidabhängigen Zustände, GTP- und GDP-gebunden, zeichnen sich durch unterschiedliche Konformationen zweier regulatorischer Schleifen (Switch I und Switch II) aus, welche maßgeblich die Effektor-Bindung beeinflussen. Der Übergang zwischen den zwei Zuständen wird durch regulatorische Proteine unterstützt, welche die Hydrolyse und den Austausch des Nukleotides beschleunigen. Die unterschiedliche zelluläre Lokalisation dieser Proteine führt zur Ausbildung eines Ran⋅GDP/GTP-Gradienten. Eine umfangreiche massenspektrometrische Studie im Jahr 2009 identifizierte fünf Acetylierungsstellen in humanem Ran, welche mittlerweile auch durch Folgestudien in anderen Organismen bestätigt wurden. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der Ran-Acetylierung auf die Funktion von Ran zu untersuchen. Des Weiteren sollten Einblicke in die Stöchiometrie und Regulation dieser post-translationalen Modifikation von Ran gewonnen werden um eine Einschätzung der physiologische Relevanz zu ermöglichen. Im Zuge der Arbeit wurde mittels Erweiterung des genetischen Codes von E.coli stellen-spezifisch acetyliertes Ran (an den Lysinen 37, 60, 71, 99 und 159) hergestellt. Die Proteine wurden gereinigt und hinsichtlich ihrer intrinsischen Eigenschaften sowie der Interaktion mit dem Nukleotid-Austauschfaktor RCC1, dem wichtigsten Import-Rezeptor Importin-β und dem Ran-bindenden Protein NTF2 untersucht. Die umfangreiche in vitro Charakterisierung zeigt, dass die Acetylierung einzelner Lysine die RCC1-Interaktion und Nukleotid-Austauschrate, sowie die Ran-Lokalisierung und die Bildung von Import-Komplexen beeinflusst. Ran-Acetylierung an den Lysinen 37, 99 oder 159 hat eine höhere Importin-β-Affinität zur Folge. Acetyliertes Lysin 71 hat einen dominant negativen Effekt bezüglich RCC1 welcher mit dem der T24N-Mutante vergleichbar ist: die Bindungsaffinität ist erhöht, während die Nukleotid-Austauschrate herabgesetzt ist. Weiterhin verhindert diese Acetylierung die Interaktion mit NTF2, was wiederum die Ausbildung des Ran-Gradienten bzw. die Lokalisation von Ran beeinträchtigt. Für Lysin 99-acetyliertes Ran war ein überwiegender Verlust der RCC1-Regulation zu beobachten, basierend auf einer verringerten Affinität und einem drastisch verringerten Nukleotid-Austausch. Die durchgeführten Untersuchungen zur Regulation der Ran-Acetylierung führten zur Identifikation Ran-spezifischer Acetyltransferasen und Deacetylasen in vitro und in vivo. Sirt1, -2 und -3 wirken als Deacetylasen auf Acetyl-Lysin 37, wohingegen Acetylierung an Lysin 71 spezifisch von Sirt2 entfernt wird. Immunoblotting und massenspektrometrische Untersuchungen identifizierten Tip60, p300 und CBP als Ran-spezifische Acetyltransferasen und die Lysine 37, 134 und 142 als hauptsächliche Acetyl-Akzeptoren. Zusammengefasst deutet die vorliegende Arbeit auf ein hohes regulatorische Potential für die Acetylierung von Ran in Abhängigkeit vom zellulären Kontext hin.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Boor, Susanne de
    Corporate Creators: Universität Köln, Cluster of Excellence - Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), Köln
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-61929
    Subjects: Chemistry and allied sciences
    Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    post-translational modification; Ran; acetylation; small GTPase; PTM; lysine-modificationEnglish
    post-translationale Modifikation; Ran, Acetylierung; kleine GTPase; PTMGerman
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Genetik
    Language: English
    Date: 2015
    Date Type: Publication
    Date of oral exam: 02 June 2015
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 14 Jul 2015 12:24:33
    Referee
    NameAcademic Title
    Lammers, MichaelDr.
    Hofmann, KayProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6194

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