Universität zu Köln

Aggregation spielt nachweislich eine wichtige Rolle, wenn Bakterien sich vor äußeren Belastungen schützen. Neisseria gonorrhoeae, ein biofilmbildender Erreger, der für die zweithäufigste sexuell übertragbare Krankheit, Gonorrhö, verantwortlich ist, stellt aufgrund seiner Multiresistenz ein ernstes Problem für die öffentliche Gesundheit dar. Toleranz, die durch längere Überlebenszeiten unter hochdosierter Antibiotikabehandlung erreicht wird, fördert die Entstehung von Resistenzen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Toleranz sind jedoch noch unbekannt. Gonokokken bilden Aggregate durch attraktiveWechselwirkungen einzelner Zellen, die durch Typ-IV-Pili (T4P) vermittelt werden. Es ist noch unklar, wie T4P die physikalischen Eigenschaften von Bakterienkolonien steuern und wie diese Eigenschaften mit der Antibiotikaresistenz zusammenhängen. Zunächst untersuchten wir, wie die T4P-Dynamik und die Zell-Zell-Interaktionen durch eine Antibiotikabehandlung beeinflusst werden. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine fluoreszenzbasierte Methode zur direkten Visualisierung von T4P sowie einen laserpinzettenbasierten Ansatz zur Charakterisierung der T4P-vermittelten Interaktionsdynamik unter externen Stressbedingungen. Mithilfe einer selbst entwickelten halbautomatischen Bildanalyse-Pipeline konnten wir feststellen, dass Pili ohne Stress mit einer beeindruckend hohen Rate von etwa 200 Pili pro Minute produziertwerden. Bei äußerem Stress, einschließlich einer Antibiotikabehandlung, wurden sowohl die Produktionsrate als auch die Dynamik von T4P reduziert. Optische Pinzettenexperimente zeigten außerdem, dass attraktive Interaktionen zwischen Zellen durch eine Antibiotikabehandlung moduliert werden. Insbesondere führt eine Erhöhung der Bindungs- und Rückzugswahrscheinlichkeit zu einer verringerten Fluidität der Kolonie, während eine Verringerung dieser Parameter zu einer erhöhten Fluidität führt. Daraus lässt sich schließen, dass die T4P-Dynamik und -Produktionsraten stark von externem Stress beeinflusst werden und einen Einfluss auf die Interaktionen zwischen den Zellen haben. T4P setzen sich aus Untereinheiten zusammen, wobei das Hauptpilin PilE ist. Die Oberfläche von T4P wird ständig variiert, da PilE antigene Variationen erfährt, ein Mechanismus, von dem auch bekannt ist, dass er die Umgehung des Immunsystems erleichtert. Wir haben untersucht, wie sich die Antigenvariation von PilE auf die bakterielle Lebensweise und Antibiotikaempfindlichkeit auswirkt. Die Bildanalyse der Oberflächenmotilität und die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigten, dass alle Pilin-Varianten die Zuckungsmotilität unterstützen und ein vergleichbares Niveau der Pilierung aufweisen. Anhand von Strukturvorhersagen mit Alpha-Fold sagten wir voraus, dass verschiedene Pilin-Varianten eine unterschiedliche Stereochemie aufweisen, die die Zell-Zell-Attraktion beeinflusst. In der Tat bestätigten Doppellaserfallen-Experimente, dass die Zell-Zell-Interaktionen verändert waren. Auf der multizellulären Ebene nahmen schwach interagierende Varianten einen planktonischen Lebensstil an, während stark interagierende Varianten Aggregate bildeten. Durch die Analyse des Überlebensanteils der Bakterien bei der Behandlung mit Antibiotika haben wir festgestellt, dass die Antibiotikatoleranz gegenüber Ceftriaxon und Ciprofloxacin bei planktonischen Bakterien deutlich verringert ist und dass aggregierende Varianten vor einer Antibiotikabehandlung geschützt sind. Wir schließen daraus, dass die stereochemischen Eigenschaften von PilE die Zell-Zell-Interaktionen modulieren und somit die bakterielle Lebensweise und damit auch die Antibiotikatoleranz beeinflussen. Wir wollten die molekularen Mechanismen identifizieren, die zur aggregationsvermittelten Toleranz beitragen, und stellten die Hypothese auf, dass Gene, die durch die Aggregation hochreguliert werden, Bakterien vor einer Antibiotikabehandlung schützen würden. Die Transkriptomanalyse ergab eine unterschiedliche Genexpression von Pilin-Varianten, die entweder eine planktonische oder eine aggregierende Lebensweise aufweisen. Wir stellten eine auffällige Hochregulierung von Pro-Phagen-Genen und Genen fest, die mit einer Verschiebung hin zur anaeroben Atmung in aggregierenden Stämmen verbunden sind, was mit der geringeren Wachstumsrate im Vergleich zu planktonischen Varianten übereinstimmt. Um die funktionelle Bedeutung für die Antibiotikatoleranz zu bewerten, wurde die Deletion der am stärksten hochregulierten Gene in Bezug auf das bakterielle Überleben unter antibiotischer Behandlung mit Ceftriaxon und Ciprofloxacin getestet. Durch Messung der Abtötungskinetik der Deletionsstämme entweder in einem planktonischen oder einem aggregierenden Pilin-Varianten-Hintergrund wurden fünf Gene identifiziert, die an der Antibiotikatoleranz beteiligt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Aggregation von Gonokokken zu einer unterschiedlichen Expression von Genen führt, die an der Antibiotikatoleranz beteiligt sind. Schließlich haben wir den Übergang von Mikrokolonien zu reifen Biofilmen von N. gonorrhoeae untersucht. In Strömungskammerexperimenten zeigte sich, dass Kolonien im Spätstadium eine Eversion durchlaufen, die durch einen nach außen gerichteten Zellfluss vom Zentrum zur Peripherie gekennzeichnet ist und lebende und tote Zellen an die Oberfläche transportiert. Ausgehend von der Hypothese, dass die Sauerstoffverarmung im Koloniezentrum die T4P-Dichte und damit den Zusammenhalt verringert, wird die Annahme aufgestellt, dass diese lokale Schwächung des Zusammenhalts der Auslöser für die Kolonie-Eversion ist. Um dies zu überprüfen, analysierten wir die räumlich-zeitliche Dynamik einzelner Zellen während der Reifung der Kolonie und stellten fest, dass die Eversion mit der Bildung einer sich ausdehnenden Hülle aus hypermotilen Zellen einhergeht, die vom Zentrum ausgeht. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Eversion durch einen verminderten Zusammenhalt im Kern der Kolonie ausgelöst wird, der durch eine Sauerstoffverarmung im Zentrum der Kolonie entsteht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie das Zusammenspiel zwischen der T4P-Dynamik, der Antigenvariation und der Antibiotikabehandlung bei der Gestaltung der bakteriellen Lebensweise und der mechanischen Eigenschaften von N. gonorrhoeae-Kolonien verdeutlicht. Insbesondere wird gezeigt, dass die Aggregation eine Schlüsseldeterminante für die Antibiotikatoleranz ist.

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