Universität zu Köln

Deutsch, Matthias ORCID: 0000-0002-0263-9612 (2020). Role of Hyperpolarization activated and Cyclic Nucleotide gated (HCN) Channels in Hippocampal Neurons. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

To fulfill their functions in processing and transmitting information by electrical potentials, neurons heavily rely on proper equipment with membrane-bound ion conducting channels. Among these, the unique properties of hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated (HCN) channels and the corresponding Ih-current contribute to various electrical properties of neurons. To elaborate on the specific role of HCN channels in shaping electrical properties of neurons, two gene-expression interfering tools, i.e. RNAi and CRISPRi, were established and evaluated. By using Adeno-associated viruses (AAVs) as gene ferries, these tools were delivered to post-mitotic neurons. Validation of both knock-down techniques showed that RNAi and CRISPRi were capable to reduce hcn-transcript levels. However, RNAi-mediated HCN-channel knock-down was more robust and efficient than CRISPRi mediated knock-down. During phylogenetic development, four different HCN channel isoforms (HCN1-4) emerged in mammals. In order to elaborate on the contribution of the individual HCN channel subunits to neuronal functions, the subunit-specific RNAi-mediated knock-down was utilized in primary hippocampal neurons. Electrophysiological experiments showed that the isoform-specific knock-downs were capable of inducing subtype-specific changes in Ih-current properties. Thus, due to their different biophysical identities, the differential expression pattern of the individual HCN channel isoforms ultimately shapes the Ih current properties to adapt to the requirements of neurons. Because neurons are incorporated into neural networks in vivo they do not function as individual units. To examine the consequences of HCN2 isoform knock-down on neuronal transmission and information integration, excitatory synaptic events were measured in primary hippocampal neurons. These experiments indicated that the HCN2 subunit might participate in both, presynaptic neurotransmitter release and postsynaptic signal integration. Furthermore, stereotaxic AAV injections and subsequent behavioral and biochemical analyses were performed to investigate the role of HCN2 in influencing hippocampal network properties. Unexpectedly, injection of AAVs in the dorsal hippocampus of adult mice resulted in severe degeneration of the CA1 pyramidal cell layer. It is unclear whether this degeneration can be attributed to the loss of HCN2 or by unacknowledged side effects.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Um ihre Funktionen in der Verarbeitung und Weiterleitung von Informationen wahrnehmen zu können, sind Neurone auf die adäquate Ausstattung mit Ionen-leitenden Kanälen angewiesen. Zu diesen Kanälen gehören, unter anderem, auch die hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten (HCN) Kanäle. Sie leiten den in seinen biophysikalischen Eigenschaften einzigartigen Ih-Strom, der maßgeblich an verschiedenen zellulären elektrischen Prozessen beteiligt ist. Um den spezifischen Einfluss der HCN-Kanäle auf die elektrischen Eigenschaften von Neuronen zu untersuchen, wurden zwei Werkzeuge (CRISPRi und RNAi) zur Beeinflussung der HCN-Kanal-Genexpression etabliert und analysiert. Durch die Verwendung rekombinanter Adeno-assoziierter Viren (rAAV) als Genfähren wurden diese Werkzeuge in post-mitotische Neuronen eingebracht. Die Validierung beider Knock-Down-Techniken zeigte, dass CRISPRi und RNAi die hcn Expression spezifisch reduzierten. Dabei erwies sich jedoch die RNAi-vermittelte Reduktion der hcn Transkripte als robuster und effizienter als die der CRISPRi-vermittelte Strategie. Bei Säugetieren entstanden, im Laufe der phylogenetischen Entwicklung, vier verschiedene HCN-Kanal-Isoformen (HCN1-4). Um den Beitrag einzelner HCN Kanal Untereinheiten zu neuronalen Funktionen zu untersuchen, wurde der Untereinheiten spezifische RNAi-vermittelte Knock-down in Primärkulturen hippocampaler Neurone angewandt. Elektrophysiologische Experimente zeigten, dass die Isoform-spezifische Reduktion zu Subtyp-spezifischen Veränderungen der Ih-Strom-Eigenschaften führte. Dies zeigt, dass die einzelnen HCN-Kanal-Isoformen aufgrund ihrer unterschiedlichen molekularen und biophysikalischen Beschaffenheit letztlich die Eigenschaften des Ih Stroms auf unterschiedliche Art und Weise prägen. Somit haben Neurone die Möglichkeit, sich durch regulierte Expression der einzelnen HCN Kanal Untereinheiten an ständig wechselnde Anforderungen, sowohl während der Entwicklung als auch in der Aufrechterhaltung neuronaler Funktionen, anzupassen. Neurone funktionieren jedoch nicht als eigenständige Einheiten, sondern sind in neuronale Netzwerke eingebunden. Um die Folgen der Reduktion der HCN2-Isoform für die neuronale Übertragung und Integration von Informationen zu untersuchen, wurden exzitatorische synaptische Ereignisse in Primärkulturen hippocampaler Neurone gemessen. Diese Experimente implizierten, dass die HCN2-Untereinheit sowohl an der präsynaptischen Freisetzung von Neurotransmittern als auch an der postsynaptischen Integration des Signals beteiligt ist. Um die Rolle der HCN2-Untereinheit in der Gestaltung der Netzwerkeigenschaften des Hippocampus zu untersuchen, wurden stereotaktische rAAV-Injektionen durchgeführt. Die Injektion in den dorsalen Hippocampus erwachsener Mäuse führte unerwarteterweise zu einer Degeneration der CA1-Pyramidalzellschicht. Ob für diese Degeneration der Verlust der HCN2 Untereinheit ursächlich ist oder aber durch Nebeneffekte hervorgerufen wurde, kann nicht abschließend beantwortet werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Deutsch, Matthias deutschm@smail.uni-koeln.de orcid.org/0000-0002-0263-9612 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-105999
Date:	28 January 2020
Place of Publication:	Köln
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > Forschungszentrum Jülich
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HCN channel UNSPECIFIED CRISPRi UNSPECIFIED RNAi UNSPECIFIED Patch-clamp UNSPECIFIED Hippocampus UNSPECIFIED
Date of oral exam:	22 January 2020
Referee:	Name Academic Title Korsching, Sigrun Prof. Dr. Baumann, Arnd Prof. Dr. Schwarz, Guenter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/10599