A potato large-insert library for isolation of candidate loci for late blight resistance and studies on their genome organization

Castillo Ruiz, Rosa Angela (2002). A potato large-insert library for isolation of candidate loci for late blight resistance and studies on their genome organization. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Summary QTL mapping of quantitative resistance to P. infestans has been pursued in potato and several loci contributing to the resistance have been identified (Leonards-Schippers et al. 1994; Meyer et al. 1998; Ewing et al. 2000; Sandbrink et al. 2000 and Naess et al. 2000). Ghislain et al. (2001) detected two major QTL effects on linkage groups VIII and XII using a hybrid cross between S. phureja x dihaploid S. tuberosum. The strong QTL effect on linkage group XII was localized in a region where no major gene or QTL for P. infestans has been reported. So far, none of the QTLs for P. infestans resistance has been cloned and the genes behind the QTLs are still unknown. Map based cloning has proved to be a promising approach for cloning genes and QTLs. This approach requires DNA markers tightly linked to the trait in combination with large insert libraries. In this study, a large insert library was constructed from one of the resistant hybrids of the population analysed by Ghislain et al. (2001). The inserts have been cloned into the binary vector pCLD04541. The clones can be used for plant transformation via A. tumefaciens. The library contains approximately 50 000 clones with an average insert size of 80 kb. The coverage of the library has been calculated to be 3-4 times the haploid potato genome. The construction of a large insert library with this genetic material will facilitate the cloning and dissection of the genes underlying the QTL once a more precise map of the region is available. The library was used to clone members of three defense related gene families: PAL(Phenylalanine-Ammonia-Lyase), PR-5 (acidic and basic osmotin) and PPO(Polyphenol oxidase). 29, 7 and 10 BAC clones containing PAL, PR-5 and PPO genes, respectively were identified. The PR-5 BAC clones were further characterized. 6 BACs containing osmotin-like sequences were grouped in two small contigs: Contig A (100kb) and Contig B (120kb). DNA markers derived from the contigs identified two genetic loci on linkage groups VIII (Contig A) and XI (Contig B). Southern gel blot analysis of genomic and BAC DNA showed that potato has at least 5 copies of osmotin genes. Most of the osmotin genes are clustered on linkage group VIII in less than 90 kb whereas only one gene is present on linkage group XI. Interestingly, Trognitz et al. (2001) using the population of Ghislain et al. (2001) reported correlation between a QTL effect derived from S. tuberosum and an osmotin RFLP marker on linkage group VIII. On the other hand, one BAC with sequence similarity to acidic PR-5 showed that acidic members of PR-5 in potato are clustered on linkage group XII, where at least 3 copies are present in less than 35 kb. S. phureja and S. tuberosum are highly homozygous at these loci which made it difficult to develop specific markers. However, two CAPS markers were derived and mapped in the maternal line S. phureja, revealing that the position of the genes do not overlap with the QTL effect. Fragments of the PR-5 BACs inserts were subcloned into pBluescript. Sequence analysis of the subclones identified 6 osmotin-like genes and 4 acidic PR-5 genes, including a copy with a truncated sequence at the N-terminus. One of the acidic PR-5 genes had 100% identity to the partial sequence of potato Protein C (Pierpoint et al. 1990). All the PR-5 ORF did not contain introns and all except the one from linkage group XI had the 16 cysteine residues highly conserved in the PR-5 family. PCR and Southern gel blot analysis demonstrated that PR-5 genes are present in all members of the Solanaceae family tested. A phylogenetic analysis of PR-5 sequences of Solanaceae from the Genebank and the genes described in this study clustered the sequences in three main branches of acidic, neutral and basic genes.

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Thesis (PhD thesis)

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Abstract

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Deutsche Zusammenfassung In der Kartoffel wurde die QTL-Kartierung der quantitativen Resitenz gegen P. Infestans in den vergangenen Jahren intensiv vorangetrieben. Mehrere Loci mit Einfluss auf dieses Merkmal konnten identifiziert werden (Leonards-Schippers et al. 1994; Meyer et al. 1998; Ewing et al. 2000; Sandbrink et al. 2000 and Naess et al. 2000). So fanden Ghislain et al. (2001) unter Verwendung einer Hybridkreuzung aus S. phureja und der dihaploiden S. tuberosum zwei Haupt-QTL-Effekte auf den Kopplungsgruppen VIII and XII. Der starke QTL-Effekt auf der Kopplungsgruppe XII wurde in einer Region lokalisiert, für welche bis zu dieser Untersuchung keine Hauptgene oder QTLs beschrieben worden waren. Bisher wurden noch keine QTLs für P. infestans Resistenz kloniert und somit sind die Gene, welche für dieses Merkmal verantwortlich sind, unbekannt. �Map based cloning� hat sich als ein vielversprechender Ansatz zum Klonieren von Genen und QTLs erwiesen. Erforderlich für diese Vorgehensweise sind zum Einen DNA-Marker, welche genetisch eng mit dem Merkmal gelcoppelt sind, und zum anderen eine genomischer Bibliothek mit großen Insertionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine solche Bibliothek mit großen Insertionen hergestellt. Hierbei wurde eine resistente Hybride aus der Population, welche Ghislain et al. (2001) analysiert hatten, genutzt. Die Insertionen wurden in den binären Vektor pCLD04541 kloniert. Diese Klone können für Pflanzentransformationen mittels A. tumefaciens genutzt werden. Die BAC Bibliothek umfasst ca. 50 000 Klone, rechnerisch das 3 bis 4 fache des haploiden Kartoffelgenoms. Sobald eine detailliertere Karte der QTL Region vorhanden ist, wird diese Bibliothek, erstellt mit spezifischen genetischen Material, es ermöglichen, dass die Gene, welche sich hinter dem QTL verbergen, kloniert und analyiert werden können. Die Bibliothek wurde genutzt, um Mitglieder von drei �defense related�-Genfamilien zu klonieren: PAL (Phenylalanine-Ammonium-Lyase), PR-5 (saüre und basische Osmotine) und PPO(Polyphenol oxidase). 29, 7 und 10 BAC-Klone wurden mit entsprechenden Pal, PR-5 und PPO Sonden identifiziert. Die PR-5 BAC-Klone wurden eingehender charakterisiert. 6 BACs mit PR-5-ähnlichen Sequenzen wurden in zwei kleinen Contigs guppiert: Contig A (100kb) und Contig B (120kb). Mit Hilfe von DNA-Markern, welche auf Basis der Contigs entwickelt wurden, konnten zwei genetische Loci auf den Kopplungsgruppen VIII (Contig A) und XI (Contig B) identifiziert werden. �Southern gel blot�- Analysen von genomischer und BAC-DNA zeigten, dass die Kartoffel mindestens 5 Osmotingene enthält. Die meisten der Osmotingene sind in einem Cluster, welches weniger als 90 kb umfasst, auf der Kopplungsgruppe VIII angeordnet; auf der Kopplungsgruppe XI befindet sich dahingegen lediglich ein Osmotingen. In diesem Zusammenhang ist es interessant, dass Trognitz et al. (2001) bei Arbeiten an der Population von Ghislain et al. (2001) eine Korrelation zwischen einem QTL-Effekt, und einem Osmotin RFLP-Marker auf Linkage-Gruppe VIII feststellten. Andererseits zeigte ein weiterer BAC, welcher Sequenzähnlichkeit mit sauren PR-5 Genen aufweist, dass saure Mitglieder der PR-5 Familie bei der Kartoffel in einem Cluster auf Kopplungsgruppe XII angeordnet sind. In diesem Cluster mit einer Grösse von weniger als 35 kb sind mindestens drei Kopien enthalten. Da S. phureja and S. tuberosum an diesem Locus sehr homozygot sind, war es schwierig, spezifische Marker zu entwickeln. Dennoch konnten in der mütterlichen Linie S. phureja zwei CAPS-Marker abgeleitet werden. Mit diesen Marken konnte gezeigt werden, dass die Position der Gene nicht mit dem QTL-Effekt übereinstimmt. Fragmente von Insertionen der PR-5 BACs wurden in pBluescript subkloniert. Durch Sequenzanalyse dieser Subklone wurden 6 Osmotin-ähnliche Genen und 4 saure PR-5 Gene identifiziert, wobei eine Kopie einen unvollständigen N-Terminus aufwies. Eines der sauren PR-5 Gene hatte eine 100%-ige Übereinstimmung mit einem Teil der Sequenz des Kartoffelproteins C (Pierpoint et al. 1990). Alle PR-5 ORFs enthielten keine Introns und alle, mit Ausnahme des Gens auf Kopplungsgruppe XI, hatten 16 Cystein Reste, die in der PR-5 Familie konserviert sind. Mit Hilfe von PCR und �Southern gel blot�- Analysen konnte gezeigt werden, dass PR-5 Gene in allen untersuchten Solanaceae Arten vorhanden sind. In phylogenetischen Untersuchungen von PR-5 Sequenzen der Solanaceae Arten, bei welchen sowohl Daten aus der Genbank als auch die in dieser Arbeit beschriebenen Gene eingingen, gruppierten die Sequenzen in drei Hauptästen mit sauren, neutralen und basischen PR-5 Genen.

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