Power, Jeffrey John
(2018).
Horizontal Gene Transfer Between Subspecies Affects Bacterial Genome Dynamics.
PhD thesis, Universität zu Köln.
Abstract
Different bacterial subspecies live in close proximity in soil. Horizontal gene transfer enables them to
exchange genetic information. Little is known about the efficiency of gene transfer and whether it occurs
randomly across the genome.
In the first part of this thesis, we designed an evolution experiment and analysis algorithm to character-
ize genome dynamics in the presence of a different subspecies. Bacillus subtilis is naturally competent
for transformation: it takes up DNA from its environment and integrates segments into its chromosome
by recombination. Eight clonal populations of B. subtilis 168 (Bsu168) were evolved with genomic DNA
from B. subtilis W23 (BsuW23) for 21 cycles. To minimize variability in transformation rates as a func-
tion of time, we generated a strain with inducible competence, and competence was induced once per
cycle. Evolved cultures had more than 100 homologous recombination events, per replicate, and the
length of recombined segments was exponentially distributed with a characteristic length of 3500 bp −1 .
Average recipient genome replacement occurred at a constant rate over the course of the experiment,
averaging 0.47% replacement every cycle. In addition to homologous recombined-segments, de novo
segments from the BsuW23 auxiliary genome and de novo variants were also detected. The de novo
segments from the auxiliary genome had a mean length of 2.2 kbp. Bacteria evolving in the presence of
BsuW23 DNA showed five times as many de novo variants in regions upstream of genes and five times as
many missense indels, compared to control samples receiving either no DNA or self (Bsu168) DNA. Of
those upstream mutations, 75% were inside a recombined segment. This hinted at the possibility of those
mutations being compensatory mutations, as upstream and missense mutations are likely to affect gene
expression levels. We conclude that the recipient genome was replaced by donor genome at a constant
rate and constant segment-length distribution, up to a total of 10% genome replacement. Introduction of
de novo variants is likely to affect the levels of gene expression.
The probability of replacing a specific gene was in good agreement with a binomial distribution,
suggesting that replacement occurred close to random across the genome. However, we found important
deviations from random integration. At both the single-cell level and the population level, we obtained
evidence that homologous recombination does not occur stochastically. At the single-cell level, imported
segments had a higher average identity, 93.6 %, than the Bsu168 and BsuW23 inter-subspecies identity
of 92.4%. Interestingly, recombined segments had one end of integration with a significantly higher
identity than expected from simulations using the same length distribution. We found that the increased
sequence identity extends to roughly 500 bp. The bias towards higher than average sequence identity is
most likely caused by the recombination process. At the population level, we found further evidence
that recombination did not occur randomly. On one hand, several genes, such as leu and eps, were
presumptively selected for, as they were replaced in nearly all replicates. On the other hand, recombined
donor segments were underrepresented in prophages and mobile-elements genes, most likely because
they correspond to auxiliary genes in each subspecies. Essential genes were overrepresented, plausibly
because essential genes have a higher average identity compared to nonessential genes. There was a
preference to replace genes and operons fully. Two-thirds of all affected genes and operons were fully
replaced. Full gene replacement is explained, in part, by the average import length being 1.9 kbp, ∼2
genes. The average operon length is also comparable, 3.2 kbp. To summarize, homologous replacement
is biased to higher than average sequence-identity. Given the length distribution of recombined segments,
the generation of hybrid genes is less likely than the replacement of full genes. Only for a few genes is
there evidence of selection.
In the second part of this thesis, we investigated the cost of competence for transformation in the
stationary growth phase. We characterized the competition dynamics of strains with various probabilities
of entering the K-state, to quantify the effect the K-state has on fitness in B. subtilis. Relative fitness was
found to decrease with increasing probability of entering the K-state, during both the exponential and
stationary growth phases. Using a microfluidic chamber, we were able to characterize generation times
in the stationary phase for both K-state and non-K-state cells. We found a strong cost of competence due
to growth inhibition, even in the stationary state. These findings emphasized that the stationary phase is
dynamic.
We conclude that gene transfer between subspecies of B. subtilis is highly efficient, with 10% of
the chromosome being replaced in a total of 42 h of competence during the evolution experiment.
DNA uptake in B. subtilis 168 from donor strain B. subtilis W23 occurred at a constant rate and fairly
random. Recombined segments had higher identities than the between-subspecies average, pointing to
the importance of sequence divergence in recombination. Several alleles were replaced in the majority of
the replicates, indicative of a selection advantage. It has been proposed that recombination is beneficial
because it can cure the recipient from prophages. In contrast, here we observed that replacement of
essential genes was overrepresented, while prophage genes were hardly affected. This suggested that gene
transfer between subspecies functions as genome maintenance. The appearance of variants, including
indels, in possible regulatory regions calls for studies of the effects of recombination on transcription. We
speculate that recombination may be suppressed between subspecies by other factors, such as quorum
sensing.
| Item Type: |
Thesis
(PhD thesis)
|
| Translated abstract: |
| Abstract | Language |
|---|
| Verschiedene bakterielle Unterarten leben im Erdreich in unmittelbarer Nähe zueinander. Horizontaler
Gentransfer ermöglicht es ihnen, genetische Informationen auszutauschen. Über die Effizienz des Gen-
transfers und darüber, ob er zufällig im Genom auftritt, ist wenig bekannt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein Evolutionsexperiment mit den benötigten Analysealgorithmen
entwickelt, um die Genomdynamik in Anwesenheit einer anderen Subspezies zu charakterisieren. Bacillus
subtilis zeigt natürliche Kompetenz: B. subtilis kann DNA aus seiner Umgebung aufnehmen und durch
Rekombination Abschnitte in sein Genom integrieren. Acht klonale B. subtilis 168 (Bsu168) Populationen
wurden für 21 Zyklen mit genomischer DNA aus B. subtilis W23 (BsuW23) evolviert. Um die Variabilität
der Transformationsrate zu minimieren, wurde ein Stamm mit induzierbarer Kompetenz generiert.
Die Kompetenz wurde einmal pro Zyklus induziert. Die evolvierten Kulturen wiesen mehr als 100
homologe Rekombinationsereignisse je Replikat auf. Die Länge der rekombinierten Segmente war
exponentiell verteilt mit einer charakteristischen Länge von 3500 bp −1 . Der durchschnittliche Austausch
des Empfängergenoms trat über den Verlauf des Experiments mit einer konstanten Rate auf, wobei pro
Zyklus durchschnittlich 0,47% ausgetauscht wurden. Zusätzlich zu den durch homologe Rekombination
eingefügten Segmenten wurden neue Abschnitte aus den nur im Genom von BsuW23 vorkommenden
Genen sowie völlig neue Varianten des Ausgangsgenmaterials detektiert. Die neuen Segmente aus
spenderspezifischen Genen besaßen eine mittlere Länge von 2,2 kbp. Bakterien, die in Gegenwart von
BsuW23 DNA evolviert wurden, zeigten im Vergleich zu Kontrollproben, welchen entweder keine
DNA oder eigene (Bsu168) DNA zugegebene wurde, fünfmal so viele neue Varianten in von Genen
aus gesehen strangaufwärts gelegenen Regionen sowie fünfmal so viele nicht synonyme Insertionen
oder Deletionen. Von den Mutationen in strangaufwärts gelegenen Regionen befanden sich 75% in
rekombinierten Abschnitten. Dies legte die Vermutung nahe, dass es sich hierbei um kompensatorische
Mutationen handelt, da strangaufwärts gelegene und nicht synonyme Mutationen wahrscheinlich einen
Einfluss auf das Genexpressionsniveau haben. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass bis zu 10% des
Empfängergenoms durch das Spendergenom ausgetauscht wurde. Die Austauschrate und die Verteilung
der Segmentlänge sind dabei konstant. Die Entstehung neuer Varianten hat mit hoher Wahrscheinlichkeit
Einfluss auf das Genexpressionsniveau.
Die Wahrscheinlichkeit, dass ein spezifisches Gen ausgetauscht wurde, stimmt mit einer Binomial-
verteilung überein, was nahelegt, dass der Ort an dem Genmaterial ausgetauscht wird zufällig über das
Genom verteilt ist. Dennoch fanden wir sowohl auf Einzelzellniveau als auch auf der Populationsebene
wichtige Hinweise auf Abweichungen von einer rein zufälligen Integration. Auf Einzelzellniveau als
auch auf der Populationsebene haben wir Hinweise darauf gefunden, dass homologe Rekombination
nicht stochastisch auftritt. Auf dem Einzelzellniveau ist die mittlere Übereinstimmung zwischen dem
importierten Abschnitt und der Ausganssequenz mit 93,6% höher als die zwischen den beiden Spezies
Bsu168 und BsuW23 von 92,4%. Interessanterweise hatten rekombinierte Segmente ein Ende mit einer
signifikant höheren Übereinstimmung, als es anhand von Simulationen auf Grundlage derselben Längen-
verteilung zu erwarten wäre. Die erhöhte Sequenzübereinstimmung erstreckt sich über eine Länge von
ungefähr 500 bp. Die Tendenz zu einer erhöhten mittleren Übereinstimmung wird vermutlich durch den
Prozess der Rekombination hervorgerufen. Auch auf der Populationsebene haben wir Hinweise darauf
gefunden, dass die Rekombination nicht zufällig auftritt. Einerseits wurde vermutlich auf einige Gene
wie leu und eps selektiert, da diese in nahezu allen Replikaten ersetzt wurden. Andererseits wurden in
Prophagengenen und mobilen Genelementen vergleichsweise wenig Spenderabschnitte integriert, ver-
mutlich da es sich bei diesen häufig um Gene handelt, welche ausschliesslich in der Spendersequenz zu
finden sind. Essentielle Gene wurden hingegen besonders häufig ausgetauscht, da diese im Vergleich zu
nicht essentiellen Genen eine besonders hohe Übereinstimmung zwischen den Subspezies aufweisen. Es
konnte eine Präferenz zum vollständigen Austausch von Genen und Operons festgestellt werden. Zwei
Drittel aller betroffenen Gene und Operons wurden vollständig ersetzt. Der vollständige Austausch der
Gene kann zumindest teilweise durch die durchschnittliche Importlänge von 1,9 kbp erklärt werden, wel-
che ungefähr der Länge von zwei Genen entspricht. Auch die mittlere Operonlänge ist mit 3,2 kbp mit
der mittleren Importlänge vergleichbar. Zusammenfassend wurde ein Trend der homologen Rekombinati-
on zu höheren Sequenzähnlichkeiten festgestellt. Ausgehend von der Längenverteilung der integrierten
Abschnitte ist die Erzeugung von Hybridgenen weniger wahrscheinlich, als der vollständige Austausch.
Hinweise auf Selektion konnten für einige wenige Gene beobachtet werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Kosten der Kompetenz in der stationären Wachstumsphase
untersucht. Dabei wurde die Konkurrenzdynamik verschiedener Stämme, mit unterschiedlichen
Wahrscheinlichkeiten in den K-Zustand zu wechseln, charakterisiert, um den Effekt des K-Zustandes auf
die Fitness in B. subtilis zu quantifizieren. Es wurde festgestellt, dass sowohl während der exponentiellen
als auch der stationären Wachstumsphase die relative Fitness mit steigender Wahrscheinlichkeit sich im
K-Zustand zu befinden abnahm. Unter Verwendung einer Mikrofluidikkammer wurden für Zellen in der
stationären Phase, die sich jeweils entweder im K-Zustand oder nicht im K-Zustand befanden, die
Generationszeiten bestimmt. Wir konnten zeigen, dass Kompetenz sogar im stationären Zustand durch
Wachstumsverminderung starke Kosten aufweist. Dies zeigt, dass die stationäre Phase dynamisch ist.
Insgesamt schlussfolgern wir, dass der Gentransfer zwischen B. subtilis Subspezies hocheffizient
abläuft, da während der 42 stündigen Kompetenz während des Evolutionsexperiments insgesamt 10% des
Chromosoms ausgetauscht wurden. Die Aufnahme der DNA des Spenderstammes B. subtilis W23 durch
den Empfänger B. subtilis 168 erfolgte nahezu zufällig und mit einer konstanten Rate. Die rekombinierten
Abschnitte hatten eine höhere genetische Übereinstimmung, als die mittlere Übereinstimmung zwischen
den Subspezies, was die Bedeutung der Sequenzdivergenz hervorhebt. Der Austausch mehrerer Allele in
der Mehrzahl der Replikate weist auf einen selektiven Vorteil hin. Im Allgemeinen wurde angenommen,
dass Rekombination von Vorteil sein kann, da es den Empfänger von Prophagen heilen kann. Im
Gegensatz dazu zeigen unsere Ergebnisse, dass sich der Austausch genetischen Materials hauptsächlich
auf essentielle Gene beschränkt, während Prophagengene kaum betroffen waren. Dies legt die Vermutung
nahe, dass Gentransfer zwischen Subspezies hauptsächlich der Erhaltung genetischen Materials dient.
Möglicherweise kann die Rekombination zwischen Subspezies auch durch andere Faktoren unterdrückt
werden, wie beispielsweise durch die Wahrnehmung der Zelldichte. Das Auftreten von genetischen
Variationen, einschließlich Insertionen und Deletionen, in möglichen regulatorischen Regionen zeigt die
Notwendigkeit von Studien zum Effekt der Rekombination auf die Transkription. | German |
|
| Creators: |
| Creators | Email | ORCID | ORCID Put Code |
|---|
| Power, Jeffrey John | UNSPECIFIED | UNSPECIFIED | UNSPECIFIED |
|
| URN: |
urn:nbn:de:hbz:38-107106 |
| Date: |
2018 |
| Language: |
English |
| Faculty: |
Faculty of Mathematics and Natural Sciences |
| Divisions: |
Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Physics > Institut für Biologische Physik |
| Subjects: |
Data processing Computer science
Natural sciences and mathematics
Physics
Life sciences |
| Uncontrolled Keywords: |
| Keywords | Language |
|---|
| Horizontal gene transfer | English | | Experimental evolution | English | | Fitness | English | | Bacillus subtilis | English |
|
| Date of oral exam: |
25 October 2018 |
| Referee: |
| Name | Academic Title |
|---|
| Maier, Berenike | Prof. Dr. | | Bollenbach, Tobias | Prof. Dr. |
|
| Refereed: |
Yes |
| URI: |
http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/10710 |
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