Universität zu Köln

Rass, Ulrich (2004). Nachweis und Charakterisierung von Crp1p, einem neuen Holliday-Struktur bindenden Protein der Hefe Saccharomyces cerevisiae. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Bei genetischen Rekombinationsvorgängen tritt eine vierarmige DNA-Struktur, die sog. Holliday-Struktur auf. Für in vitro Experimente wird ein Strukturanalog, die sog. X-DNA verwendet. Eine Reihe sehr unterschiedlicher Proteine ist in der Lage, diese charakteristische DNA-Struktur spezifisch zu erkennen. In einigen Fällen lässt sich ein klarer Bezug zur Rekombination herstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues X-DNA bindendes Protein der Hefe Saccharomyces cerevisiae entdeckt. Durch eine Serie von Flüssigkeitschromatographien wurde es aus Rohextrakten soweit angereinigt, dass seine Identität geklärt werden konnte. Die Identifikation gelang mit Hilfe der Southwestern Technik. Eine anschließende Proteinsequenzierung ergab, dass es sich um das bisher uncharakterisierte Produkt des offenen Leserasters YHR146W handelte. Dem 465 Aminosäuren umfassenden Protein wurde der funktionelle Name Cruciform DNA-Recognising Protein 1 (Crp1p) gegeben. Das Gen CRP1 wurde kloniert und in E. coli exprimiert. Die Aktivität des rekombinanten Proteins in EMSAs bestätigte Crp1p als Urheber der mit Hefe-Extrakten beobachteten Aktivität. Das rekombinante Protein erwies sich allerdings als anfällig für eine effiziente posttranslationale Spaltung in der direkten Umgebung von Aminosäure 160. Dabei ergibt sich ein X-DNA bindendes N-terminales- und ein unter bestimmten Bedingungen X-DNA bindendes, aber in Anwesenheit von Kompetitor-DNA inaktives, C-terminales Subpeptid. Die auf der Architektur des DNA-Substrates beruhende DNA-Bindung des N-terminalen Peptids wird durch eine neuartige X-DNA-Bindedomäne vermittelt. Diese besitzt nach derzeitigem Stand eine 22 Aminosäuren umfassende, positiv geladene Minimalsequenz, die als autonomes X-DNA bindendes Subpeptid fungieren kann. Phänotypische Untersuchungen an crp1-Mutanten ergaben bislang keinen Hinweis auf eine Beteiligung an Rekombinationsprozessen. So ließ sich keine erhöhte Sensitivität gegenüber UV- oder Röntgenstrahlung und kein meiotischer Defekt nachweisen. Um weiter zu klären, an welchem molekularen Ablauf Crp1p beteiligt ist, wurde mit Hilfe der Hefe-2-Hybrid-Analyse nach Proteinen gesucht, die mit Crp1p in Wechselwirkung treten. Dabei wurden zwei RNA bindende Proteine, Drs1p und Gno1p gefunden. Beide sind an der rRNA-Reifung beteiligt, so dass die Möglichkeit aufgeworfen wurde, dass Crp1p in vivo nicht strukturierte DNA, sondern RNA bindet.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Detection and characterisation of Crp1p, a new Holliday-junction-binding protein of the yeast Saccharomyces cerevisiae English
Translated abstract:	Abstract Language A central intermediate of genetic recombination is the four-way DNA junction termed Holliday-junction. For in vitro experiments this DNA-structure is replaced by an analogous synthetic substrate, the so-called X-DNA. A number of very different proteins has been found to specifically bind to this structure. Some of them are clearly connected to recombination. This work describes a new X-DNA-binding protein of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Using different chromatography media, it was purified from yeast extracts to an extent that allowed for identification. After detection by Southwestern analysis the protein was isolated for sequencing. It turned out to be an as yet uncharacterized product of the open reading frame YHR146W. The protein of 465 amino acids was given the functional name Cruciform DNA-Recognising Protein 1 (Crp1p). The respective gene was cloned, expressed in E. coli and the product was analysed in electromobility shift assays. The observed substrate specificity confirmed that Crp1p is indeed responsible for the X-DNA-binding activity observed in yeast extracts. Recombinant Crp1p proved instable and was shown to be posttranslationally cleaved at around amino acid 160. This leads to an N-terminal subpeptide with intrinsic X-DNA-binding activity and a C-terminal subpeptide that is capable of binding X-DNA only in the absence of competitor DNA. The structure specificity of the N-terminal peptide is mediated by a novel X-DNA-binding domain. This domain - as determined so far - is made up by 22 amino acids and of positive charge. When expressed as an independent subpeptide, it showed autonomous X-DNA-binding capacity. Up to now, phenotypic analysis of crp1 mutants gave no hint of Crp1p participating in recombination. Thus, no elevated UV- or X-ray-sensitivity and no meiotic defect could be detected. To further investigate in which molecular process Crp1p might function, interaction partners were sought for by yeast 2-hybrid analysis. Interestingly, two RNA-binding proteins, Drs1p and Gno1p, were identified. Both of them function in pre-rRNA processing in ribosome synthesis, which raises the possibility that the in vivo target for Crp1p is structured RNA rather than structured DNA. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Rass, Ulrich uli.rass@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-10792
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Holliday-Struktur , X-DNA , Crp1p , Strukturspezifität , Rekombination German Holliday-junction , X-DNA , Crp1p , structure-specific , recombination English
Date of oral exam:	8 February 2004
Referee:	Name Academic Title Kemper, Börries Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1079