Universität zu Köln

Eeda, Satish Kumar (2019). Analysis of the full-length WOX4 promoter activity in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The understanding of vascular development in plants has been advanced rapidly in the last decades. Nevertheless, there are still many details to be elucidated about the early stages of vascular differentiation, which requires easily identifiable marker genes. The WUSCHEL-related homeobox 4 (WOX4) is a member of the WOX gene family (Eric van der Graaff, 2009) and it has been demonstrated that WOX4 is involved in cambial stem cell maintenance (Suer et al., 2011). Existing WOX4 expression analyses in Arabidopsis thaliana were conducted with a short WOX4 promoter-reporter construct, which contains 2.9 Kb of the 5′ flanking region and 0.6 Kb of the 3′ flanking region (Ji et al., 2010; Y Hirakawa et al., 2010; Suer et al., 2011; Shi et al., 2019). These studies describe a cambial cell specific expression pattern of WOX4 promoter in the root, shoot, cotyledons and leaves (Y Hirakawa et al., 2010). In upper part of the inflorescence stem, WOX4 activity was confined only to fascicular cambium, but at the stem-base its activity extends into the interfascicular region and forms a circular expression domain and this pattern was implied to be responsible for the radial outgrowth of the stem (Suer et al., 2011). However, by detailed sequence analyses in this study we demonstrate that the WOX4 sequence is spatially separated by long intergenic sequences, which contain several distal conserved regions. Moreover, by comparing phylogenetic shadowing results with published ATAC-seq data (Frerichs et al., 2019) we show the positions of these conserved regions are in open chromatin configurations, suggesting a possible regulatory role of these areas in WOX4 expression pattern. Hence, we have generated WOX4 promoter-reporter fusions, which contains 9.2 Kb upstream and 1.7 Kb downstream sequences from the WOX4 coding sequence and transferred into A. thaliana with the aim to find a full spectrum of WOX4 activity. Interestingly, the analyses of transgenic plants aligned with previously observed cambium cell specific WOX4 activity but additionally it marked novel WOX4 expression domains in the SAM, RAM, stem and leaves. In the stem, the full-length WOX4 promoter activity starts in groups of cells of the inflorescence meristem (IM), possibly marking the provascular cells of emerging primordia. Approximately 80-100 μm beneath the IM, the promoter activity was localized in a circular expression domain of subcortical region that prepatterns the vasculature of young stem. This circular WOX4 expression domain was found to exist throughout the inflorescence stem and intrusions in the circle marks 6 fascicular cambium and interfascicular mark strands. Our findings suggest that the full-length WOX4 promoter was active during the specification of provascular cells in the shoot apex, initiation of fascicular cambium in the young stem without losing competency in the interfascicular mark strands and then continuously active in the cambial ring of the matured stem. Additionally, its activity was also observed in the xylem parenchyma in different growth phases of the inflorescence stem. Similar to the shoot, the WOX4 promoter activity was also found to start in the RAM marking the QC and its adjacent meristematic cells. Then its activity was found to confined to the vascular system of root. In the leaf, the WOX4 promoter was active in the primary, secondary, tertiary and quaternary veins, marking the cambial cells of the complete leaf vascular system. Additionally, it was also active in the xylem parenchyma of leaf vascular bundles and the sub-epidermal cells in adaxial side of the leaf, marking the palisade parenchyma. Taken together, our study indicates that the inclusion of distal conserved regions of the WOX4 promoter is essential to show the picture of WOX4 expression pattern in different organs of A. thaliana. Hence, the full-length WOX4 promoter-reporter constructs analysed in this study could further be utilised to elucidate the gene regulatory networks that control vascular development. However, the complete upstream region is too large to be used as a standard promoter, therefore further promoter dissection studies are needed to identify the cis-regulatory elements, which could then be used for engineering approaches.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language UNSPECIFIED English
Translated abstract:	Abstract Language Das molekularbiologische Verständnis der Gefäßentwicklung bei Pflanzen ist in den letzten Jahrzehnten weit vorangeschritten. Nichtsdestotrotz gibt es immernoch Details der frühen Entwicklungsstadien der vaskulären Differenzierung, die noch nicht vollständig beschrieben sind und von einfach detektierbaren Markergenen profitieren würden. WUSCHEL-related homeobox 4 (WOX4) gehört zur WOX Genfamilie (Eric van der Graaff, 2009). Es wurde gezeigt, dass WOX4 an der Stammzell-Aufrechterhaltung im Kambium beteiligt ist (Suer et al., 2011). Existierende WOX4 Genexpressionsanalysen in Arabidopsis thaliana wurden mit einem vergleichsweise kurzen WOX4 Promoter-Reporter Konstrukt, welches 2.9 Kb der 5′ flankierenden Region und 0.6 Kb der 3′ flankierenden Region umfasst, durchgeführt (Yuki Hirakawa et al., 2010; Shi et al., 2019). Diese Studien berichten von einer Kambium-spezifischen Expression des WOX4 Promoters in Wurzeln, Spross, Kotelydonen und Blättern (Y Hirakawa et al., 2010). Im oberen Teil der Sprossachse der Infloreszenz beschränkte sich die WOX4 Aktivität auf das faszikuläre Kambium, wohingegen sich die Aktivität in der Basis der Sprossachse auf die interfaszikülare Region ausgeweitete und eine zirkuläre Domäne formte. Dieses Expressionsmuster könnte das radiale Wachstum der Sprossachse einleiten (Suer et al., 2011). In einer detailierten Sequenzanalyse zeigen wir hier, dass die WOX4 Sequenz räumlich von langen, intergenischen Sequenzen abgegrenzt ist, welche im distalen Bereich konservierte Regionen enthalten. Darüberhinaus zeigen wir durch den Vergleich von phylogenetic shadowing- Ergebnissen mit publizierten ATAC-seq Daten (Frerichs et al., 2019), dass die Positionen der konservierten Regionen in offenen Chromatinbereichen liegen, was uns zu der Hypothese führt, dass sie eine wichtige regulatorische Rolle in der WOX4 Expression spielen könnten. Aus diesem Grund wurden in dieser Studie WOX4 Promoter-Reporter Fusionen generiert, die den 9.2 Kb upstream Bereich und den 1.7 Kb downstream Bereich der WOX4 kodierenden Sequenz umfassen. Die Promoter-Reporter Konstrukte wurden in A. thaliana transferiert mit dem Ziel das volle Spektrum der WOX4 Aktivität zu erfassen. Interessanterweise stimmten die Analysen der transgenen Pflanzen mit der vorher beschriebenen Kambium-spezifischen WOX4 Aktivität überein, jedoch konnten zusätzlich markierte, neue WOX4 Expressionsdomänen im SAM, RAM, Sprossachse und Blätter identifiziert werden. 8 In der Sprossachse beginnt die Aktivität des WOX4 Volllänge-Promoters in Zellgruppen des Inflorezenzmeristems (IM) was möglicherweise provaskuläre Zellen der sich entwickelnden Primordien markiert. Circa 80-100 μm unterhalb des IMs zeigte sich eine zirkuläre Expressionsdomäne der subcorticalen Region, welche das Muster der Vaskulatur der jungen Sprossachse anzeigt. Diese zirkuläre WOX4 Expressionsdomäne zog sich durch die Sprossachse der gesamten Infloreszenz, wobei Einstülpungen des Kreisens das faszikuläre als auch Kambium markieren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der WOX4 Volllänge-Promoter während der Spezifizierung der provaskulären Zellen in der Sprosspitze aktiv ist, während der Initiierung des faszikulären Kambiums in der jungen Sprossachse ohne seine Kompetenz im interfaszikulären Markstrahl zu verlieren aktiv bleibt und seine Aktivität dann auch kontinuierlich im Kambiumring der reifen Sprossachse zu finden ist. Zusätzlich konnte seine Aktivität im Xylemparenchym in verschiedenen Wachstumsphasen der Sprossachse der Infloreszenz beobachtet werden. Wie im Spross zeigte sich die WOX4 Promoteraktivität auch im RAM wo sie das QC und die angrenzenden meristematischen Zellen markierte. Außerdem beschränkte sich die Aktivität auf die Vaskulatur der Wurzel. Im Blatt befand sich die WOX4 Promoteraktivität in den primären, sekundären, tertiären und quartären Venen, wo sie die Kambiumzellen der kompletten Blattvaskulatur markierten. Zusätzlich konnte seine Aktivität in Xylemparenchymzellen der Bündelscheidenzellen und der subepidermalen Zellen der adaxialen Seite des Blattes lokalisiert werden, wo sie das Palisadenparenchym markierte. Zusammengefasst zeigt unsere Studie, dass der Einbezug der distalen, konservierten Promoterregionen essentiell für die volle Entfaltung der WOX4 Expression in den verschiedenen Pflanzenorganen von A. thaliana ist. Die in dieser Studie analysierten Volllänge WOX4 Promoter-Reporter Konstrukte könnten weiterhin der Erforschung der regulatorischen Netzwerke, welche die Gefäßentwicklung in Pflanzen steuern, dienen. Allerdings eignet sich die vollständige Upstream-Region aufgrund ihrer Größe nicht zum Einsatz als Standardpromoter. Stattdessen wäre es sehr interessant detailierte Promoterstudien an dieser Upstream-Region durchzuführen, um kleinere cis-regulatorische Elemente zu identifizieren, die in Zukunft in biotechnologischen Verfahren an Pflanzen eingesetzt werden können. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Eeda, Satish Kumar satish.eeda@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-115970
Date:	2019
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institut für Entwicklungsbiologie
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language promoter UNSPECIFIED A.thaliana UNSPECIFIED
Date of oral exam:	7 February 2020
Referee:	Name Academic Title Werr, Wolfgang Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/11597