Biosynthese der Luteolin-Glucuronide im Roggenprimärblatt-Mesophyll: Charakterisierung der Glucuronosyltransferasen

Freiesleben, Konstanze (2004). Biosynthese der Luteolin-Glucuronide im Roggenprimärblatt-Mesophyll: Charakterisierung der Glucuronosyltransferasen. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
konstanze-freiesleben-dissertation.pdf
Download (10MB)

Abstract

Pflanzen sind in der Lage, sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe (z.B. Flavonoide) sowie pflanzenfremde Substanzen (z.B. Xenobiotika) zu "entgiften". Dies geschieht über eine Reaktionsabfolge, in der die toxische Substanz aktiviert (Phase I), dann z.B. durch die Konjugation mit einem Zucker (Phase II) in eine hydrophilere Verbindung überführt und schließlich - um das Cytosol vor toxischen Effekten zu schützen - in der Vakuole gespeichert wird (Phase III). Die bisher beschriebenen pflanzlichen Sekundärstoff-Zuckertransferasen verwenden zumeist UDP-Glucose als Cosubstrat. Im Gegensatz hierzu sind an Vertebraten-Entgiftungsprozessen vorwiegend UDP-Glucuronosyltransferasen (UGTs) beteiligt. In den Vakuolen photosynthetisch aktiver Mesophyllzellen von Roggenprimärblättern akkumulieren Luteolin-Di- bzw. Tri-Glucuronide. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Enzyme, die die sequenzielle Synthese der Luteolin-Glucuronide katalysieren molekularbiologisch und biochemisch charakterisiert werden. Durch die Durchmusterung einer genomischen Roggenphagenbank mit heterologen Zuckertransferase-Sonden konnten zwei neue Zuckertransferase-Gene mit hoher Sequenz-Homologie zu Vertebraten-UGTs isoliert werden (scUGTa-c). Die Transkription dieser Gene im 5 Tage alten Roggenprimärblatt wurde mittels NORTHERN-blot-Analyse bzw. Durchmusterung einer cDNA-Bank nachgewiesen. Die biochemische Charakterisierung der Roggen-Flavonoid-Zuckertransferasen beinhaltete die Etablierung des in vitro Enzymtests für die sequenzielle Glucuronidierung von Luteolin bzw. für die Glucosylierung (3-Flavonol-Glucosyltransferase-Enzymtests) von Cyanidinen und Flavonolen. Die Reaktionsprodukte wurden mittels HPLC analysiert. Das Molekulargewicht von 53 kDa wurde durch eine Immunblotanalyse und eine Protein-G-vermittelte Coimmunpräzipitation bzw. einen Lectinbindungsassay auf dem Proteinchip mit heterologen UGT-Antikörpern bestimmt. Die Lokalisation der Luteolin-Glucuronosyltransferasen im Cytosol wurde durch eine Differenzialzentrifugation ermittelt. Durch die transiente Expression fluoreszierenden Fusionsproteine in Gersteprimärblättern (particle bombardment) konnte die "cytosolische Lokalisation" eingegrenzt werden: die Roggenenzyme befinden sich offensichtlich mit dem ER bzw. dem Tonoplasten assoziiert. Um die Anzahl der für die Biosynthese des Luteolin-Triglucuronids verantwortlichen Enzyme zu ermitteln, wurde eine 2D-Gelelektrophorese durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass nur zwei (nicht wie erwartet drei) Proteine mittels Immunblot detektiert werden konnten. Die bei tierischen Enzymen beschriebene Homodimerisierung der UGTs konnte anhand einer FRET-Analyse durch acceptor-photo-bleaching bei den Roggen-UGTs bestätigt werden. Der Enzymassay mit heterolog exprimierter scUGT (in E.coli bzw. N.tabacum / A.thaliana) führte jedoch weder zu einer Akkumulation von Cyanidin-3-O-Glucosid (3FGT-Reaktion), noch zu einer von Luteolin-Mono- / -Di- bzw. -Tri-Glucuroniden (UGT-Reaktion).

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Creators: