Universität zu Köln

Libotte, Thorsten (2004). Charakterisierung von NUANCE, einem Protein der alpha-Aktinin Superfamilie. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

NUANCE ist ein Protein der a-Aktinin Superfamilie, das eine Aktin-Bindungs-Domäne, 22 Spektrin-Domänen und eine Transmembran-Domäne enthält. Das NUANCE Gen erstreckt sich über eine Länge von 373 kb auf dem humanen Chromosom 14. Die cDNA ist 21,8 kb lang und kodiert für ein Protein mit einer Masse von 789 kDa. Durch selektive Permeabilisierungstechniken und Immunfluoreszenzstudien auf subzellulärer Ebene konnte gezeigt werden, dass NUANCE auf der äußeren Kernmembran, im Nucleoplasma und in Kern-nahen Bereichen lokalisiert ist. Eine Untersuchung der Aktin-Bindungs-Domäne offenbarte, dass NUANCE F-Aktin in vitro binden kann. Dabei zeigte das Fusionsprotein 6xHis-ABD eine Bündelungsaktivität und eine Steigerung der Polymerisationsrate von F-Aktin. Die ermittelte Dissoziationskonstante Kd = 3,8 ± 1 µM von 6xHis-ABD zu F-Aktin liegt in derselben Größenordnung wie die des nahe verwandten Proteins Enaptin. Durch den Einsatz des �Yeast Two-Hybrid�-Systems konnte eine direkte Interaktion von NUANCE und Lamin A festgestellt werden. Ferner war NUANCE nach einem �Knockdown� von Lamin A/C mit Hilfe von RNAi nicht mehr in der Kernmembran lokalisiert. Eine Zerstörung des Lamin A/C Netzwerks durch eine dominant-negative GFP-Lamin B-Form hatte ebenfalls eine Miss-Lokalisation von NUANCE zur Folge. Bindungsanalysen zeigten eine direkte Interaktion von NUANCE mit einem gemeinsamen Bereich von Lamin A und C. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass NUANCE mit Lamin A/C auch in vivo interagieren kann. Eine Untersuchung der hoch konservierten Klarsicht-Domäne mit Hilfe von GFP-Fusionsproteinen zeigte, dass diese Domäne für eine Kernmembranlokalisation ausreichend ist und die Fusionsproteine endogenes NUANCE verdrängen können. Bindungsanalysen des lumenalen Bereichs von NUANCE und SUN1/UNC84 zeigten eine direkte Interaktion der beiden Proteine. Eine Miss-Lokalisation von Emerin konnte durch einen �Knockdown� von NUANCE mit Hilfe von RNAi gezeigt werden. Die Expression von C-terminalen GFP-Fusionsproteinen, die nur die Transmembran-Domäne und den lumenalen Bereich enthalten, hatte ebenfalls eine Miss-Lokalisation von Emerin zur Folge. NUANCE gehört mit Enaptin zu den ersten Proteinen der a-Aktinin Superfamilie, die die potentielle Fähigkeit besitzt, das Aktin-Cytoskelett mit dem Zellkern zu verbinden und aufgrund ihrer Interaktionen mit Emerin, Lamin A/C und SUN1/UNC84 eine Organisatorrolle am Zellkern übernehmen können. Die Interaktionen mit Lamin A/C und Emerin lassen vermuten, dass Mutationen innerhalb des NUANCE Proteins für Muskeldystrophien und Laminopathien verantwortlich sein könnten.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language NUANCE was identified as a protein with an a-actinin-like actin binding domain, 22 spectrin repeats and a transmembrane domain which is embedded in a so called klarsicht domain. A human 21 kb cDNA of NUANCE spreads over 373 kb on chromosome 14q22.1-q22.3 and predicts a protein of 798 kDa. At the subcellular level NUANCE is present predominantly at the nuclear membrane, in the nucleoplasm and in the vicinity of the nucleus in the cytoplasm. NUANCE binds F-actin in vivo and in vitro. The fusion protein 6xHis-ABD containing the actin binding domain shows actin bundling and actin polymerization activity. The dissociation constant Kd = 3,8 ± 1 µM of NUANCE is similar to the one of the closely related enaptin. Yeast two hybrid analysis shows a direct interaction with lamin A. Selective disruption of the lamin A/C network in COS7 cells using a dominant negative lamin B mutant resulted in the redistribution of NUANCE. Furthermore, the siRNA knockdown of lamins A/C in keratinocytes caused the dispersal of NUANCE from the nuclear envelope. Using biochemical techniques, we demonstrate that NUANCE binds directly to a C-terminal common region of lamins A/C implicating that NUANCE is also localised in the inner nuclear membrane. Experiments regarding the klarsicht domain of NUANCE show that this domain is sufficient for proper localisation and guidance to the nuclear envelope. GFP fusion proteins containing the klarsicht domain localise at the nuclear envelope, are able to displace endogenous NUANCE and cause a significant shrinkage of the nucleus. Using binding assays, we show that the lumenal part of NUANCE and the nuclear envelope protein SUN1/UNC84 are interacting directly. Expression of dominant negative NUANCE constructs or NUANCE knockdown with RNAi in COS7 cells revealed that the presence of NUANCE at the nuclear envelope is necessary for the proper localization of emerin. Thus, NUANCE and enaptin are the first a-actinin related proteins that have the potential to link the microfilament system with the nucleus. The data imply a scaffolding function of NUANCE at the nuclear membrane and suggest a potential involvement of this protein in muscular dystrophies. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Libotte, Thorsten Thorsten.Libotte@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12042
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language NUANCE , Kernmembran , Aktin , Lamin A/C German NUANCE , nuclear envelope , actin , lamin A/C English
Date of oral exam:	15 June 2004
Referee:	Name Academic Title Noegel, Angelika Anna Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1204