Isolierung und Charakterisierung von Zielgenen des homöotischen Transkriptionsfaktors DEFICIENS aus Antirrhinum majus

Bey, Melanie (2003). Isolierung und Charakterisierung von Zielgenen des homöotischen Transkriptionsfaktors DEFICIENS aus Antirrhinum majus. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
PhD_MelanieBey.pdf
Download (3MB)

Abstract

DEFICIENS (DEF) ein homöotisches MADS-Box Gen, reguliert die Organogenese der Petalen und Stamina, welche sich in zwei benachbarten Wirteln der A. majus Blüte entwickeln. Die Zielgene, durch die das regulatorische Potential von DEF während der Entwicklung der Blütenorgane realisiert wird, sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Für die korrekte Ausprägung von Petalen und Stamina ist die kontinuierliche DEF Expression von Phasen der Organinitiierung bis in späte Entwicklungsstadien hinein notwendig. Daher wird angenommen, dass DEF die Expression von unterschiedlichen Zielgenen sowohl in frühen, als auch in späten Phasen reguliert. Auf der Basis morphologischer Kriterien wurden die späten Differenzierungsphasen der Petalenentwicklung in vier definierte Stadien (P1-P4) eingeteilt. Aus den mit ihnen durchgeführten Expressionsprofil-Experimenten ging hervor, dass mindestens ein Fünftel der in Sepalen und Petalen exprimierten Gene während der Petalenentwicklung reguliert werden. Funktionelle Analysen definierter Subgruppen von ko-regulierten Genen zeigten, dass Veränderungen in der Genexpression morphologischen Differenzierungsprozessen zugeordnet werden können. Zudem unterliegt der größte Teil der Petalen-spezifisch exprimierten Gene einer hohen zeitlichen Regulation. Die frühe Petalenentwicklung bis Ende des Stadiums P1 ist Zellteilungs-geprägt. Der enorme Längenzuwachs der späten Petalenstadien P3 und P4 wird dagegen durch Zellstreckungsprozesse realisiert. Das Petalenstadium P3 wurde aufgrund der dort festgestellten hohen Regulationsaktivität von DEF zur Isolierung von Zielgenen ausgewählt. Mittels der konditionellen def-101 Mutante wurden in weiteren Expressionsprofil-Experimenten 108 ESTs ermittelt, deren Expression in Folge einer reduzierten DEF-Funktion reguliert wird. Dabei zeigte sich, dass DEF zu gleichen Teilen als Aktivator und Repressor agiert. In unabhängigen Expressions-Studien konnten von einer Auswahl dieser Gene über 80% als differentiell exprimiert bestätigt werden. Funktionelle Analysen dieser DEF-Zielgene zeigten, dass DEF in dem untersuchten Petalenstadium P3 hauptsächlich Prozesse des Zellwandmetabolismus aktiviert und notwendig ist, um die Expression von Genen die an der Photosynthese beteiligt sind, zu reprimieren. Darüber hinaus wurde die Expression von sechs ausgewählten dieser über 100 DEF-Zielgene detailliert charakterisiert. Neben semiquantitativen RT-PCR-Analysen in WT Organen, wurde die durch DEF vermittelte Transkriptionsregulation der aus Petalen P3 isolierten Gene auch in Stamina des gleichen Stadiums und jungen Infloreszenzen untersucht. Abschließend wurde eine in vivo Interaktion des DEF Proteins mit isolierten Promotorfragmenten der ausgewählten DEF-Zielgene mittels X-ChIP-PCR-Analysen überprüft. Dabei konnte für das Extensin-ähnliche Gen DEFTup 1, dessen Transkription nachweislich durch die DEF-Funktion reguliert wird gezeigt werden, dass DEF direkt oder als Bestandteil eines Proteinkomplexes mit dem Promotor des Zielgens interagiert. In dieser Arbeit wurde somit ein System kombinierter Methoden zur Isolierung von DEF-Zielgenen etabliert, mit dem über 100 neue, unter der Kontrolle des homöotischen Transkriptionsfaktors stehende Gene isoliert wurden. Abgesehen von der autoregulativen Transkriptionskontrolle von DEF und GLO durch das Heterodimer ihrer eigenen Proteine, konnte mit DEFTup 1 das erste direkte Zielgen von DEFICIENS nachgewiesen werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Isolation and characterization of target genes of the homeotic transcription factor DEFICIENS from Antirrhinum majus	English

Translated abstract:

Abstract

Language

DEFICIENS (DEF), a homeotic MADS-Box gene controls petal and stamen organogenesis in the second and third whorl of the A. majus flower. Target genes that realize the regulatory potential of DEF during flower development are almost unknown. Constant DEF expression from the time of organ initiation to late developmental stages is crucial for proper development of both floral organs. This lead to the assumption that DEF expression regulates different target genes in early and late stages of flower development. The late phases of differentiation in petal development were divided into four stages (P1-P4) based on their morphological characteristics. Expression profiling experiments demonstrated that at least one fifth of sepal and petal genes are regulated differentially during petal development. Functional analysis of defined subgroups of co-regulated genes revealed that changes in gene expression correlate with processes of morphological differentiation. Additionally, many petal-specific genes exhibit a distinct temporal expression pattern. Early petal development until the end of stage P1 is dominated by cell division. The dramatic growth in length of petals during stages P3 and P4 is predominantly based on cell expansion processes. The developmental phase P3 showed high regulation activity and was chosen for the isolation of DEF target genes. In additional expression profiling experiments conducted with the conditional def-101 mutant 108 ESTs with altered expression as a consequence of a reduced DEF-function were identified. By that DEF was shown to act both as transcriptional activator or repressor. Independent expression studies on a selection of these genes confirmed that 80% are differentially expressed. Functional analysis of these stage P3 petal target genes revealed that DEF activates cell wall metabolism and represses genes involved in photosynthesis. Furthermore six of about 100 DEF target genes were selected and characterized in detail. In addition to semi-quantitative RT-PCR analyses in WT organs, the DEF-mediated transcription regulation of the isolated genes was analyzed in stamens stage 3 and young inflorescences. Finally, X-ChIP-PCR-analyses were carried out to investigate the in vivo interaction of DEF protein with isolated promoter fragments of selected DEF target genes. In case of the the extensin-like gene DEFTup 1 it was demonstrated, that its transcription is regulated by DEF and that DEF interacts directly or as part of a protein complex with the promoter of this target gene. In this work a system of combined methods for the isolation of DEF target genes was established. More than 100 genes were identified to be transcriptionally controlled by DEF. Apart from the auto-regulative transcription control of DEF and GLO by their corresponding protein heterodimer, DEFTup 1 was shown to be the first direct target gene of DEFICIENS.

English

Creators: