Tumor-Matrix Interaktionen: Ihre Bedeutung für die Regulation der lysosomalen Cysteinprotease Cathepsin B am Beispiel des malignen Melanoms

Klose, Anke (2005). Tumor-Matrix Interaktionen: Ihre Bedeutung für die Regulation der lysosomalen Cysteinprotease Cathepsin B am Beispiel des malignen Melanoms. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die Invasion maligner Melanomzellen ist ein komplexer Prozess, in dem Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen eine wesentliche Bedeutung einnehmen. Dabei ist die Fähigkeit der Zellen, in das Gewebe einzuwandern von der Expression verschiedener Adhäsionsmoleküle und der Degradation extrazellulärer Matrixkomponenten abhängig. Die Penetration der Basalmembran der dermoepidermalen Junktionszone stellt hierbei einen initialen Schritt der Melanomzellinvasion dar und ist somit entscheidend für den Übergang von benignen zu malignen Wachstumsprozessen. Eine vermehrte Expression der lysosomalen Cysteinprotease Cathepsin B konnte bereits in einer Reihe von Tumormodellen nachgewiesen werden. Die Bedeutung der Zell-Matrix Interaktionen für die molekularen Regulationsmechanismen von Cathepsin B, die zu einer erhöhten Aktivität der Protease und somit zur Progression maligner Wachstumsprozesse führen, sind jedoch bislang nicht bekannt. Innerhalb dieser Dissertation wurde daher die Rolle lysosmaler Cysteinproteasen während der Invasion humaner Melanomzellen durch dermales Bindegewebe oder bei der Überwindung der Basalmembran in in vitro Invasionsmodellen aus humaner deepidermisierter Haut untersucht. Wir konnten zeigen, dass während der Invasion des dermalen Bindegewebes sowohl aktive MMPs als auch aktive Cathepsine nachweisbar waren, wohingegen während der Penetration der Basalmembran ausschließlich aktive Cathepsine detektiert wurden. Zudem konnte durch die spezifische Inhibition von Cathepsin B die Invasion hoch-invasiver Melanomzellen durch die Basalmembran deutlich reduziert werden, was die Beteiligung dieser Protease bei initialen Schritten der Melanomzellinvasion hervorhebt. Die Expression und zelluläre Lokalisation des Cathepsin B und seiner endogenen Inhibitoren wurde in vitro in einer rekonstituierten Matrix aus fibrillärem Kollagen Typ I charakterisiert, die in vivo-ähnliche Verhältnisse simuliert. Im Gegensatz zu niedrig-invasiven Melanomzellen, konnte in intermediär- und hoch-invasiven Zellen, in Abwesenheit des nativen Kollagens, sowohl eine erhöhte intrazelluläre Proteasekonzentration als auch eine Ausschleusung von Cathepsin B nachgewiesen werden. Durch den Kontakt der Zellen zu nativen Kollagenfibrillen wurde zusätzlich eine vermehrte extrazelluläre Lokalisation reifer Formen der Protease induziert. Durch den Einsatz inhibitorischer anti-β1 Intgrinantikörper konnten wir zeigen, dass die extrazelluläre Lokalisation der Protease über β1-Integrine vermittelt wurde. Des Weiteren wurde sowohl eine Hemmung der Procathepsin B Sekretion / Prozessierung als auch eine Inhibition der lysosomalen Exocytose reifer Cathepsin B Formen beobachtet, wenn MMPs und Serinproteasen innerhalb der Kollagengele inhibiert wurden. Diese Resultate weisen darauf hin, dass MMPs und Serinproteasen für Melanomzell-Kollagen Interaktionen benötigt werden, die zur Ausschleusung von Cathepsin B führen. Zell-Kollagen Interaktionen regulierten zudem die Synthese der endogenen Inhibitoren Cystatin B und C, unabhängig von der Invasivität der analysierten Zellinien. Betrachtet man jedoch die Nettoproteinmengen, so wird deutlich, dass im Gegensatz zu niedrig-invasiven Zellen in den hoch-invasiven Zellen ein verändertes Cathepsin / Inhibitor Verhältnis vorliegt, welches intra- und extrazellulär deutlich zugunsten der aktiven Protease verschoben ist. Da die Etablierung der LDS-Zymographie uns die Detektion aktiver Cathepsine ermöglichte, konnten wir zudem zeigen, dass hoch-invasive Melanomzellen neben Cathepsin B auch aktives Cathepsin L sezernieren, wodurch die Balance zwischen Cathepsinen und endogenen Inhibitoren weiter reduziert wird. Die Analyse molekularer Mechanismen der Tumorzell-ECM vermittelten Regulation der Synthese, Sekretion und Aktivität von Cathepsin B unterstreicht die Rolle lysosomaler Cysteinproteasen bei der Tumorzellinvasion und zeigt neue Ansätze zur Entwicklung therapeutischer Konzepte des malignen Melanoms auf.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Tumor-Matrix Interactions and their Role in the Regulation of the Lysosomal Cysteineprotease Cathepsin B in Malignant Melanoma	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Invasion of malignant melanoma cells is a complex process characterized by several cell-cell and cell-matrix interactions. The invasive capacity of cells is dependent on the expression of various adhesion molecules as well as on the degradation of peritumoral extracellular matrix. The degradation of basement membrane components of the dermo-epidermal junction is one of the initial steps of melanoma cell invasion characterizing the transition from benign to malignant tumor growth. An increased expression of the lysosomal cysteine protease cathepsin B has been shown in various tumor models. However, little is known about the role of lysosomal cysteine proteases in tumor invasion and about the regulatory mechanisms underlying enhanced cathepsin B activity during tumor growth. In the present work we analyzed the role of lysosomal cysteine proteases during the invasion of human melanoma cell lines through dermal connective tissue or basement membranes using in vitro invasion models of deepidermized human skin. We showed that, besides MMPs, also active cathepsins could be detected during the invasion of connective tissue, whereas during penetration of basement membranes only active cathepsins but not MMPs were observed. Reduction of the invasion of high-invasive cells through basement membranes was obtained upon inhibition of cathepsin B activity, thus underlining the involvement of this protease in early invasion processes. We have further characterized the expression and cellular localization of cathepsin B and its endogenous inhibitors in in vitro cultures of melanoma cells using a reconstructed matrix composed of native collagen type I fibrils. In absence of contacts with extracellular collagen type I, intermediate- and high-invasive, but not low invasive melanoma cells, displayed not only increased intracellular cathepsin B levels but also extracellular protein release. Upon contact of the cells to native collagen fibrils, we observed increased extracellular localization of mature cathepsin B. The increased extracellular localization was mediated by 1 integrin subunit as shown by inhibition experiments with inhibitory anti-1 integrin antibodies. In addition, inhibition of MMPs and serine proteases in these three-dimensional culture systems, resulted in the inhibition of both, procathepsin B secretion / processing and lysosomal exocytosis. These results indicate that both MMPs and serine proteases are required for cell-collagen interaction leading to regulation of cathepsin B localization. Cell-collagen interactions also regulated the synthesis of the endogenous inhibitors cystatin B and C in all cell lines analyzed, independently of their invasive potential. However, an imbalance of the cathepsin / inhibitor ratio was observed only in high-invasive melanoma cells thus resulting in an imbalance that can lead to intra- and extracellular increase in protease activity. By LDS-zymography, detecting enzymatic activity of cathepsins, we could demonstrate that high-invasive melanoma cells, besides to active cathepsin B, also secrete active cathepsin L. The presence of both active cathepsins further contributes to the imbalance between cathepsins and endogenous inhibitors. The results gained on the molecular mechanisms involved in tumor cell-ECM mediated regulation of cathepsin B synthesis, secretion and activity, highlight the role of lysosomal cysteine proteases in tumor cell invasion and outline new aspects for the developement of melanoma therapies.

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