Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice

Wunderlich, Frank Thomas (2004). Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Inducible gene targeting based on the Cre/loxP system is a novel technique allowing conditional gene modification in mice. Precondition of this method is the regulation of Cre activity by inducible genetic switches. This study aimed at improving inducible systems for the regulation of Cre activity at both the transcriptional and the posttranslational level, which should be tested first in vitro and subsequently in newly generated transgenic mice. In order to detect Cre activity, a special double indicator consisting of DsRed and eGFP was constructed and targeted into the ROSA26 locus of HM-1 ES cells. This indicator should constitutively express the DsRed gene flanked by loxP sites. Cre-mediated recombination excises the DsRed gene and turns on the eGFP gene, as evidenced by a change in fluorescence from red to green. Though the double indicator worked properly in transiently transfected fibroblasts, the targeting strategy used for the integration of the indicator into the ROSA26 locus presumably disrupted a putative stem loop motif of the 5'UTR resulting in a silencing of the indicator at the protein level. However, the ES cell line with the integrated double indicator is suited for targetings of inducible Cre constructs into the HPRT locus, since inducibilities are detectable by Southern Blot analysis. The Cre*PR system was one inducible system I have established. In contrast to the classical CrePR1 system, the background activity of Cre*PR was almost abolished by introducing a point mutation into the 3'end of the Cre part, thus preventing aberrant splicing of the Cre*PR encoding mRNA. Also, the PR-LBD of the Cre*PR system was improved, compared to the CrePR1, to obtain a higher affinity towards the inducer RU486. The Cre*PR system, driven by either the EF1£\ promoter or the CAGGS promoter, was then targeted into the HPRT locus. The CAGGS Cre*PR worked in ES cells as expected. These targeted ES cells were subsequently used to generate transgenic mice. In these mice, high protein levels of Cre*PR have to be obtained in order to achieve inducible Cre-mediated excision of loxP-flanked gene segments. In addition, I generated a novel B cell specific Cre*PR mouse strain by targeting Cre*PR into the mCD19 locus. In another approach to inducibly regulate Cre, a tet-on system was established consisting of the rtTA-M2 transactivator and the tetresponsive Cre cassette, which was targeted into the HPRT locus of the double indicator ES cell line. This system revealed a tight regulation of Cre expression in a doxycycline dependent manner.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Induzierbare gezielte Mutagenese basierend auf dem Cre/loxP System ist eine neue Methode, die es erlaubt Gene konditional in Mäusen zu verändern. Vorraussetzung dafür ist die Regulierung von Cre durch induzierbare genetische Schalter. Diese Arbeit zielte darauf ab die Schalter für die Regulation von Cre auf transkriptionellem und posttranslationalem Niveau zu verbessern, diese zuerst in vitro zu testen und dann in transgenen Mäusen. Um die Cre Aktivität zu detektieren, wurde ein spezielles, doppeltes Reporterkonstrukt für Cre, welches aus DsRed und eGFP besteht, konstruiert und in den ROSA26 Locus von HM-1 ES Zellen eingebracht. Dieser Reporter sollte konstitutiv das von loxP Sequenzen flankierte DsRed Gen ausprägen. Cre vermittelte Rekombination schneidet das DsRed Gen aus und stellt das eGFP Gen an, was durch einen Fluoreszenzwechsel von rot zu grün sichtbar wird. Obwohl der Doppel Reporter in transient transfizierten Fibroblasten funktionierte, zerstörte das gezielte Einbringen des Reporters in den ROSA26 Locus vermutlich ein bisher unbekanntes, mögliches Stamm-Loop-Motiv der 5' untranslatierten Region der ROSA26 mRNA, was zu einem Verlust der Translation führte. Die Reporter ES Zell Linie wurde jedoch weiterhin genutzt, um induzierbare Cre Konstrukte in den HPRT Locus einzubringen, da man deren Induzierbarkeit über Southern Blot nachweisen kann. Das Cre*PR System war eines der induzierbaren Systeme, die ich etabliert habe. Gegenüber dem klassischen CrePR1 System wurde die Hintergrundaktivität des Cre*PR Systems durch Einführen einer Mutation am 3' Ende vom Cre Anteil fast abgestellt, welche kryptische Spleißereignisse der Cre*PR kodierenden mRNA verhindert. Auch die PR-LBD des Cre*PR Systems wurde gegenüber dem CrePR1 System verbessert um eine höhere Affinität zum Induktor RU486 zu erreichen. Das Cre*PR System wurde gezielt in den HPRT Locus eingebracht, und dann entweder vom CAGGS oder dem EF1£\ Promoter ausgeprägt. Das CAGGS Cre*PR Konstrukt zeigte in ES Zellen eine stringent regulierbare Cre Aktivität und die ES Zellen wurden somit genutzt um transgene Mäuse herzustellen. In diesen Mäusen mussten hohe Cre*PR Proteinkonzentrationen erreicht werden um induzierbare Cre vermittelte Rekombination zu erreichen. Ein neuer B Zell spezifischer Cre*PR Maus Stamm wurde durch das gezielte Einbringen des Cre*PR in den mCD19 Locus hergestellt. In einem weiteren Ansatz Cre induzierbar zu regulieren, wurde ein tet-on System etabliert, welches aus dem rtTA-M2 Transaktivator und der tet-ansprechenden Expressionskassette für Cre besteht, welches weiterhin in den HPRT Locus der Doppelreporter ES Zell Linie eingebracht wurde. Experimente in ES Zellen zeigten eine stringente Doxyzyklin abhängige Regulation der Cre Expression.

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