Universität zu Köln

Schmiemann, Viola (2005). Methylierung als molekularbiologischer Marker zur Lungenkarzinom-Diagnostik. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF Dissertation.pdf Download (2MB)

Abstract

In dieser Arbeit wurde ein diagnostischer Test für Lungenkarzinome entwickelt, der aberrante Promotormethylierungen als Tumormarker nutzt. Der Nachweis der Promotormethylierungen erfolgte an DNA aus Bronchialsekreten nach Bisulfitkonversion mittels quantitativer methylierungsspezifischer real-time PCR (QMSP). Hierfür wurden Primer/TaqMan®-Sonden-Paare für verschiedene Promotorregionen konstruiert und in Fall-Kontroll-Studien an insgesamt 297 Bronchialsekreten (112 Lungenkarzinome, 85 Nicht-Tumor-Fälle) untersucht. Durch den Vergleich von DNA aus Bronchialsekreten und Formalin fixierten Tumorgeweben mittels QMSP sowie Sequenzierung der Promotorregionen konnte gezeigt werden, daß die Marker APC und RARB2 eine Schädigung des Bronchialepithels nachweisen und als Risikomarker einzustufen sind. RASSF1A und p16INK4a erwiesen sich hingegen als spezifische Tumormarker. Letztendlich wurden drei für diagnostische Zwecke geeignete Marker zu einem Panel zusammengestellt (APC, p16INK4a und RASSF1A). In einer retrospektiven Kohortenstudie an 235 Bronchialsekreten (111 Lungenkarzinome, 103 Nicht-Tumor-Fälle, 21 sonstige Tumoren) konnten die Ergebnisse der Fall-Kontroll-Studien verifiziert werden. Lungenkarzinome wurden mit einer Sensitivität von 52% bei einer Spezifität von >99% detektiert. Durch die Kombination des molekularbiologischen Tests mit der herkömmlichen zytologischen und histologischen Diagnostik gelang es, 88% der Lungenkarzinome bei der ersten Bronchoskopie zu diagnostizieren. Die QMSP mit einem drei Marker Panel stellt den ersten praxistauglichen von der Morphologie unabhängigen molekularbiologischen Lungenkarzinom-Test dar. So konnten 40% der Lungenkarzinomfälle mit Bronchialsekreten ohne morphologisch sichtbare Tumorzellen identifiziert werden. Weiterhin wurde bei 80% der zytologisch als dringend verdächtig eingestuften Befunde ein Karzinom nachgewiesen. Da der Test an Restmaterial der regulären Zytologie durchgeführt wird, ist er ohne Umstellung der Routineabläufe optimal in die Diagnostik integrierbar. Damit besitzt der Test ein sehr großes Potential bei diagnostischen Problemfällen. Unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen die Base 5-Methylcytosin gelang es mittels Bild-Zytometrie erstmals, Hypomethylierung an histologischen Schnittpräparaten von Plattenepithelkarzinomen bei Erhalt der Zellmorphologie zu quantifizieren. Die Plattenepithelkarzinome wiesen in 80% der untersuchten Fälle eine globale Hypomethylierung auf, wobei der 5-Methylcytosingehalt durchschnittlich 29,4% geringer als bei den Referenzzellen war.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Aberrant methylation as diagnostic marker for lung cancer English
Translated abstract:	Abstract Language In this study, a diagnostic test for lung cancer was developed using aberrant promoter methylation as a tumormarker. For the detection of promoter methylation, DNA was isolated from bronchial secretions, treated with sodium-bisulfite and analyzed with a quantitative methylation specific real-time PCR (QMSP). For the QMSP, primer/TaqMan®-probe sets for different promoter-regions were designed and tested in case-control-studies comprising 297 bronchial secretions (112 lung cancers, 85 non-tumor-cases). Applying QMSP as well as sequencing of promoter regions to DNA from bronchial secretions and corresponding formalin fixed tumor-tissue showed that the markers APC and RARB2 detect an epigenetic damage of the bronchial epithelium and may therefore be classified as risk markers. In contrast, RASSF1A and p16INK4a proved to be tumor-specific. Finally, three useful markers for diagnostic purposes were combined to a panel (APC, p16INK4a, RASSF1A). In a retrospective cohort-study comprising 235 bronchial aspirates (111 lung cancers, 103 non-tumor-cases, 21 other tumors) the results of the case-control-studies were verified. Using QMSP lung cancer was detected with a sensitivity of 52% and a specificity of >99%. Combining the molecular test with conventional cytology and histology, lung cancer was diagnosed in 88% at the first bronchoscopy. The methylation assay represents the first diagnostic test for lung cancer which fits for every day use and is independent of cell morphology. Thereby 40% of lung cancer cases with bronchial secretions lacking morphologically visible tumor cells could be identified. Furthermore, in 80% of cases with highly suspicious cytology the tumor was confirmed. The test can be accomplished using residual material of regular cytology. Therefore, it can be integrated in diagnostic routine without changes of the standard procedures. As a result, the newly developed test has a great diagnostic potential. For the first time it was possible to quantify DNA hypomethylation in histological sections of squamous-cell carcinomas using a monoclonal antibody raised against the base 5-methyl-cytosine and analysing the staining results with image-cytometry. The squamous-cell carcinomas showed global hypomethylation in 80% of the studied cases. In average the 5-methyl-cytosine content of tumor cells was 29.4% lower than in respective reference cells. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schmiemann, Viola v.schmiemann@t-online.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-14985
Date:	2005
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Lungenkarzinom , Bronchialsekret , Methylierung , Diagnostik , real-time-PCR German lung cancer , bronchial aspirate , methylation , diagnostic , real-time-PCR English
Date of oral exam:	24 April 2005
Referee:	Name Academic Title Dohmen, R. Jürgen Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1498