Universität zu Köln

Budhiraja, Ruchika (2005). Post-translational modification of proteins by SUMO in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Among the systems that modify protein structure, the covalent attachment of small ubiquitin like modifier - SUMO protein to its substrates (sumoylation) represents after ubiquitylation, the best studied example of post-translational modification by a protein modifier. SUMO is a peptide of approximately 100 amino acids that modifies proteins of many organisms including yeast, humans and plants. SUMO is covalently linked to other proteins via a set of specific enzymes, namely SUMO-activating enzyme (SAE), SUMO-conjugating enzyme (SCE) and SUMO ligases. These enzymes are homologous to E1 - E2 - E3 cascade that operates in ubiquitylation. SUMO is emerging as a versatile modifier for a large number of proteins in many different pathways and the consequences of this modification seem to be as diverse as its targets. Arabidopsis thaliana has eight full-length genes with significant similarity to animal and fungal SUMO proteins. Phylogenetic analysis clustered the Arabidopsis SUMO proteins into five subfamilies: SUMO1\2, SUMO3, SUMO5, SUMO 4\6 and SUMO 7\8. To identify and characterize SUMO substrates in plants, we developed transgenic Arabidopsis thaliana lines expressing tagged versions of all the SUMO isoforms. Of all these genes expressed in Arabidopsis, four (SUMO1\2, SUMO3 and SUMO5) are highly expressed and form conjugates with substrate proteins in vivo. Following expression of the affinity tagged SUMO1 and subsequent biochemical enrichment, an array of high molecular weight SUMO1 substrates was revealed on a Coomassie stained gel. MALDI-TOF analysis identified 25 novel potential sumoylation targets in Arabidopsis, some of which carried the consensus sumoylation motif. We were able to demonstrate that one of these identified sumoylation substrates (NAF) is an in vitro target for sumoylation. All SUMO isoforms are made as inactive precursors. They mature by a carboxyl-terminal proteolytic cleavage which yields the mature modifier with exposed carboxyl terminus di-glycine motif. In order to test the requirement for these residues in conjugation reactions, we substituted the double glycine residues with alanine-glycine, glycine-alanine and alanine-alanine in a SUMO1 transgene. These individually modified SUMO1 transgenes were expressed in Arabidopsis. Contrary to the expectation, substrates were visidualized on immunoblotting with all the expressed SUMO variants, which demonstrates the extreme flexibility of the plant SUMO conjugation system. Moreover, an accumulation of SUMO substrates was evident from immunoblot experiments with transgenic Arabidopsis plants expressing a SUMO1 (Q93A) mutant. Furthermore, we investigated Arabidopsis plants with decreased capacity to conjugate SUMO to its target substrates. These plants expressed a mutated version of SUMO conjugating enzyme (AtSCE) in which the active site cysteine residue was changed to serine (C94S). Phenotypic characterization of these plants deficient in sumoylation showed stunted morphology and early flowering characteristics both under short and long day light conditions as compared to the wild type counterparts. Immunoblot analysis revealed that these transgenic lines had lower levels of free endogenous SUMO. Generally, the results suggest that similar to other eukaryotic organisms, many proteins in plants also undergo post-translational modification via sumoylation and this process has functional significance for development and cell biology of Arabidopsis thaliana.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Posttranslationalen Veränderung von Proteinen bei SUMO in Arabidopsis thaliana German Post-translational modification of proteins by SUMO in Arabidopsis thaliana English
Translated abstract:	Abstract Language Zusammenfassung Das kleine ubiquitin-ähnliche Protein SUMO kann kovalent mit Substratproteinen verknüpft werden. Neben der Ubiquitylierung ist dies der am besten untersuchte Fall einer posttranslationalen Veränderung von Proteinen durch Anheften sogenannter Modifikatorproteine. SUMO besteht aus ca. 100 Aminosäuren und wird in Eukaryonten, z. B. in Hefe, Menschen und Pflanzen, an Substrate angeheftet. Dazu dienen spezifische Enzyme, nämlich SUMO aktivierendes Enzym SAE, SUMO konjugierendes Enzym SCE und SUMO Ligasen. Diese Enzyme sind homolog zur Enzymkaskade E1, E2 und E3, welche die Konjugation von Ubiquitin katalysiert. SUMO stellt sich als vielseitig verwendetes Modifikatorprotein heraus, das eine große Zahl an Substraten in verschiedenen Stoffwechsel und Signaltransduktionswegen aufweist, und die Konsequenzen der Modifikation scheinen so vielfältig zu sein wie die Substratproteine selbst. Arabidopsis thaliana hat acht Gene mit Ähnlichkeit zu SUMO aus Pilzen oder Tieren. Phylogenetisch können sie in fünf Gruppen eingeteilt werden: SUMO1/2, SUMO3, SUMO5, SUMO4/6, und SUMO7/8. Vier der Arabidopsis SUMO Gene, SUMO1, 2, 3 und 5, werden stark exprimiert und in vivo zur Bildung von Konjugaten herangezogen. Um SUMO Substrate in Pflanzen zu identifizieren und zu charakterisieren, wurden SUMO Gene aller Gruppen mit Epitop-Tag versehen und in der Pflanze Arabidopsis thaliana exprimiert. Nach Expression von SUMO1 mit Epitop-Tag und biochemischer Anreicherung wurde eine Reihe hochmolekularer Konjugate im Coomassie-gefärbten Gel erhalten. MALDI-TOF Analyse erlaubte die Identifizierung von 25 neuen potentiellen Substraten der Sumoylierung in Arabidopsis. Einige dieser Kandidatenproteine enthalten ein sogenanntes Konsensus-Sumoylierungs-Motif. Es konnte gezeigt werden, dass eines dieser Proteine, NAF, auch in vitro ein Substrat der Sumoylierung ist. Alle SUMO Proteine werden zunächst als inaktive Vorstufen hergestellt. Die Reifung erfolgt durch proteolytische Spaltung am Carboxyl-Terminus, an dem ein Di-Glycin Motif freigelegt wird. Um zu testen, ob diese beiden terminalen Aminosäuren für die Konjugation essentiell sind, wurden SUMO Varianten hergestellt und getestet, die Alanin-Glycin, Glycin-Alanin oder Alanin-Alanin an deren Stelle aufweisen. Anders als erwartet konnten in Arabidopsis Konjugate mit allen Varianten nachgewiesen werden, was die hohe Flexibilität des pflanzlichen SUMO Konjugationssystems belegt. Es konnte auch die Anhäufung von Konjugaten nachgewiesen werden, welche nach Expression von SUMO 1 mit einem Glutamin zu Alanin Austausch in Position 93 in Arabidopsis entstanden. Weiters wurden Pflanzen untersucht, deren Fähigkeit zur Bildung von SUMO Konjugaten durch Expression eines veränderten SUMO konjugierenden Enzyms beeinträchtigt war. Im veränderten Enzym ist das Cystein des aktiven Zentrums durch Serin ersetzt. Phänotypische Charakterisierung der exprimierenden Pflanzen zeigte Kleinwüchsigkeit und frühzeitige Blühinduktion im Lang - sowie im Kurztag. Analyse mittels Immunoblot ergab, dass die veränderten Pflanzen eine geringere Konzentration an freiem SUMO aufweisen. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass ähnlich wie in anderen Eukaryonten viele Pflanzenproteine durch SUMO modifiziert werden können und dass dieser Prozess wichtig ist für Entwicklung und Zelluläre Funktionen von Arabidopsis thaliana. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Budhiraja, Ruchika ruchika@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16103
Date:	2005
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Posttranslationalen Veränderung , SUMO, Arabidopsis thaliana German Posttranslational modification, SUMO, Arabidopsis thaliana English
Date of oral exam:	5 December 2005
Referee:	Name Academic Title Coupland, George Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1610