Universität zu Köln

Quadt, Ilja (2005). Untersuchungen basaler Transkriptionsfaktoren im Infektionsverlauf großer DNA-Viren. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Das zentrale Interesse dieser Studien bestand darin, den Einfluss der Infektion großer DNA-Viren auf den basalen Transkriptionsapparat der Wirtszellen zu untersuchen. Die frühe Genexpression des Baculovirus AcMNPV erfolgt durch die zelluläre RNAP II. Die späten und die hyperexprimierten sehr späten viralen Gene werden hingegen durch eine viruskodierte RNA-Polymerase transkribiert. Es wird angenommen, dass der basale zelluläre Transkriptionsfaktor TBP in der frühen baculoviralen Transkription involviert ist, wohingegen eine Beteiligung von TBP an der späten Infektion unbekannt ist. Expressionsanalysen zeigten einen signifikanten Anstieg der TBP-Proteinmenge in der späten AcMNPV-Infektionsphase, der im Gegensatz zur beschriebenen virusinduzierten Abnahme der zellulären Genexpression stand. Somit ergab sich die Frage, wie der TBP-Anstieg durch das Virus induziert wird, und welche Bedeutung er für die Infektion hat. Nach Hemmung der Translation konnte eine hohe Stabilität von TBP nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu steht ein plötzlicher Abfall der gestiegenen TBP-Menge in infizierten TN-368-Zellen, so dass ein aktiver virusinduzierter Abbaumechanismus von TBP möglich ist. In Lokalisierungsstudien konnte kein direkter Zusammenhang dieses TBP-Abbaus mit dem Ubiquitin-Proteasomen-Weg hergestellt werden. In der ebenfalls permissiven Zelllinie Sf21 wurde der Abfall der TBP-Proteinmenge nicht beobachtet. Lokalisierungsstudien zeigten eine TBP-Relokalisierung von einem granulären Färbemuster im gesamten Zellkern in distinkte Kerndomänen ab der frühen Infektionsphase. Diese Kernstrukturen kolokalisierten mit viralen Replikationszentren und nahmen simultan und in Abhängigkeit von den Orten der viralen DNA-Synthese an Größe zu. In RNA-Interferenzstudien zur Analyse der Bedeutung der Baculovirus-induzierten TBP-Zunahme konnte die TBP-Proteinmenge nur in uninfizierten Zellen reduziert werden, nicht aber in der späten Infektionsphase. Die vergleichsweise durchgeführten Reduktionen der viralen Transkriptions- und Replikationsfaktoren IE2, DBP und LEF-4 zeigten keine Wirkungen auf die Expression der frühen viralen Proteine und von TBP. Nach der Blockierung von DBP konnte in der späten Phase der Infektion eine signifikante Erhöhung der Proteinmengen von viralen LEF-Proteinen beobachtet werden, die jedoch keinen messbaren Effekt auf die Synthese viraler Strukturproteine oder auf die Bildung von Virus-Polyedern hatte. Die Hemmung der postulierten RNA-Polymerase-Untereinheit LEF-4 führte zum Verlust der späten und sehr späten viralen Strukturproteinsynthese und der Virusproduktion. Vergleichsanalysen während der HSV-1-Infektion, in der ausschließlich die Wirts-RNAP II für die virale Transkription genutzt wird, zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Expression von TFIID-Komponenten. In Lokalisierungsstudien konnten die RNAP II und die TFIID-Untereinheiten TBP, TAF1 und TAF4 ab der frühen Phase der Infektion in distinkten Kerndomänen beobachtet werden, die mit Orten der viralen DNA-Synthese kolokalisierten. Die initiale Relokalisierung der basalen Transkriptionsfaktoren in Präreplikationszentren schien unabhängig von replizierender viraler DNA stattzufinden, wohingegen die Größenzunahme der Kernstrukturen in Abhängigkeit von viralen DNA-Replikationszentren geschah. Diese Daten zeigen erstmals eine Zunahme des TBP-Proteins in der späten Baculovirus-Infektionsphase und deuten damit auf eine Beteiligung von TBP an der Hyperexpression der sehr späten viralen Faktoren hin. In einem offenbar konservierten Mechanismus im Infektionsverlauf großer DNA-Viren findet die virale Transkription an Orten der viralen DNA-Synthese durch Rekrutierung von TFIID-Untereinheiten statt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die freigesetzten Virusgenome direkt für die Transkription zugänglich sind, so dass basale Transkriptionsfaktoren in Replikationszentren rekrutiert werden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language This study aims to understand the influence of large DNA viruses on the basal transcriptional machinery of the host cell. The gene expression cascade of the baculovirus AcMNPV is temporally regulated. Host RNAP II recognizes early viral promoters, whereas late genes and the hyperexpressed very late genes are transcribed by a virus-encoded RNA polymerase. Little is known about the involvement of host cell factors in late transcription. In contrast to the general shut down of host protein synthesis during infection, a significant increase of the TBP protein was observed during the late and very late phases of AcMNPV infection. Inhibitor studies revealed a high stability of TBP in uninfected cells. Thus the reduction of initially increased TBP in TN-368 cells postulates an active degradation of TBP during infection. A direct correlation of decreasing TBP and the ubiquitin-proteasome pathway was not detectable. In indirect immunofluorescence studies relocalization of TBP was observed in the early phase of infection. TBP localized to distinct nuclear compartments which colocalized with viral DNA replication sites. As soon as viral DNA replication was visible in distinct nuclear sites, colocalization with TBP was observed. TBP redistribution was shown to be dependent on viral DNA synthesis. RNA interference studies were carried out for analysing the baculovirus-induced TBP protein level increase. TBP could only be reduced in uninfected cells, but not during the late phase of infection. In comparison, viral transcription and replication factors IE2, DBP and LEF-4 could be silenced which revealed no influence on the expression of early viral genes or TBP. Inhibition of DBP led to a significant increase of viral LEF protein levels during the late phase of infection. However, this did not result in a measurable effect on the synthesis of structural virus proteins or formation of viral polyhedra. Inhibition of the virus-encoded RNA polymerase component LEF-4 resulted in a loss of expression of late and very late viral structural proteins and the formation of viral progeny. The HSV-1 genome is transcribed by host RNAP II throughout early and late phases of infection. When expression of TBP and a set of different TAFs was analyzed during HSV-1 infection no significant effect on the protein levels of TFIID components was found. RNAP II and the TFIID subunits TBP, TAF1 and TAF4 were relocated to distinct nuclear structures in the early phase of infection. Initial redistribution of TBP and TAFs to prereplicative sites appears to be independent on early viral replication; further accumulation of the TFIID components, however, correlates with formation and enlargement of viral DNA replication compartments. Taken together these results provide first evidence for an increase of the TBP protein level during the late phase of baculovirus infection and postulate that TBP is involved in the hyperexpression of very late viral factors. Viral transcription takes place at sites of viral DNA synthesis by recruiting TFIID subunits which represents a conserved mechanism during the infection cycle of large DNA viruses. This finding suggests that incoming viral genomes are directly accessible for transcription so that basal transcription factors are recruited in viral DNA replication compartments. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Quadt, Ilja iquadt@gmx.net UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16283
Date:	2005
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > no entry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language TBP , TAF , Baculovirus , HSV-1 , RNAi German TBP , TAF , Baculovirus , HSV-1 , RNAi English
Date of oral exam:	4 December 2005
Referee:	Name Academic Title Knebel-Mörsdorf, Dagmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1628