Universität zu Köln

Lafos, Marcel (2006). Komplementationsstudien der cpd-Mutante und Analyse der CPD-Interaktionspartner mittels reverser Genetik. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Anhand von Komplementationsstudien der cpd-Mutante konnte die Funktionalitaet eines CPD-GFP-Fusionsproteins in planta demonstriert werden. Die Komplementation erfolgte unter Kontrolle des endogenen CPD-Promotors und unter Kontrolle des konstitutiven CaMV-35S-Promotors. Die transgenen Pflanzen wurden zur zellulaeren und gewebespezifischen Lokalisation des CPD-Proteins verwendet. Die Lokalisation des CPD-Proteins an der ER-Membran konnte sowohl ueber die Detektion der GFP-Fluoreszenz des generierten CPD-Fusionsproteins als auch mit einer Westen-Blot-Analyse eines differentiell zentrifugierten Zellextrakts bestaetigt werden. Konditionale Komplementationsstudien der cpd-Mutante verdeutlichen die wichtige Rolle von Brassinosteroiden bei der Pflanzenentwicklung. Durch konditionale, biochemische Komplementationen wurde demonstriert, daß Brassinosteroide kontinuierlich waehrend der Pflanzenentwicklung benoetigt werden. Durch die konditionale genetische Komplementation der cpd-Mutante mit einem Oestradiol-induzierbaren Komplementationskonstrukt und der Verwendung eines unabhaengigen, induzierbaren GUS-Reporterkonstruktes war es moeglich einen Steroidtransport in planta nachzuweisen. Anhand des induziebaren GUS-Konstruktes wurde die inhomogene Oestradiol-Verteilung nach der lokal begrenzten Applikation mit Oestradiol-haltiger Lanolinpaste gezeigt. Verschiedene Studien belegen den Transport des Oestradiols. Die entsprechende lokale Komplementation der cpd-Mutante hat eine ganzheitliche Reaktion der Pflanze gezeigt, was einen Transport des Syntheseendprodukts Brassinolid oder eines nachgeschalteten Signals belegt. Die Analyse der CPD-Interaktionspartner ueber reverse Genetik hat zur Identifikation der iap2-1-Mutante gefuehrt, die eine T-DNA-Insertion in einem, fuer ein Ringfingerprotein-codierendes Gen traegt. Die Mutante weist einen vergleichbaren Phaenotyp wie CPD-Ueberexpressionslinien auf, die auf Kontrollmedium ein verstaerktes Wurzelwachstum entwickeln. Die iap2-1-Mutante zeigt auf Hochsteroidmedium eine hypersensitive Reaktion gegenueber Brassinolid, was auf einen veraenderten, endogenen Steroidgehalt oder eine modulierte Signaltransduktion hindeutet. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der postulierten Funktion des IAP2-Ringfingerproteins, das als E3-Ubiquitin-Ligase an der Regulation der CPD-Proteinstabilitaet beteiligt sein kann. Es bleibt aber offen, ob IAP2 an der direkten Regulation des CPD-Proteins oder einer anderen Komponente der Brassinosteroidsignaltransduktion beteiligt ist. Die Analyse von T-DNA-Insertionsmutanten in fuenf OBP-Genen hat nicht zur Identifikation eines Steroidphaenotyps gefuehrt. Damit zeichnet sich eine redundante Funktionalitaet innerhalb der OBP-Proteinfamilie aus A. thaliana ab, wie sie z. B. bei den homologen OSH-Proteinen in Hefe beobachtet wurde ab. Analysen von Doppel- und Mehrfachmutanten der CPD-Interaktionspartner und insbesondere der obp-Mutanten werden ein genaueres Bild der IAP und OBP-Funktion geben.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Complementation of the cpd-mutant and analysis of CPD-interacting partners by reverse genetics English
Translated abstract:	Abstract Language Conditional complementation of the cpd (constitutive photomorphogenesis and dwarfism) mutant could clarify the indispensable role of brassinosteroids in plant development. Complementation of cpd demonstrated that a CPD-GFP protein fusion was functional and complementation was observed when the fusion construct was placed under the control of the endogenous CPD promoter or the constitutive CaMV-35S promoter. The resultant transgenic plants were used for cellular and tissue specific localization of the CPD protein. The CPD protein was localized to the ER-membrane, as determined by detection of CPD-GFP fusion protein fluorescence and confirmed by western blot analysis after differential centrifugation of cellular extracts. Biochemical complementation assays demonstrated that brassinosteroids are continuously needed throughout plant development. Furthermore, it could be demonstrated that in planta steroid transport occurs using a estradiole inducible expression system. This was achieved in the cpd background using a estradiole inducible CPD-GFP complementation construct and confirmed using an independent estradiole inducible GUS reporter construct in wildtype plants. The study of the estradiole-inducible construct revealed a non-homogenous distribution of estradiole in planta after the local application of a estradiole-containing lanolin paste. Local complementation of cpd leads to simultaneous growth stimulation in the entire plant, suggesting transport of brassinosteroids or a transducer signal. Several putative CPD interaction partners, including the OBP (OXYSTEROL BINDING PROTEIN) and the IAP (RING-finger E3 Ligase) proteins were characterized. Genetic analysis of the IAP partners led to the identification of an iap2-1 knockout mutant, which carries a T-DNA insertion in the coding region of the gene. The mutant displays increased root growth on control medium, which is comparable to the phenotype of CPD-overexpressor lines. The iap2-1 mutant is hypersensitive to brassinolide when placed on high-steroid medium. This suggests that endogenous steroid levels are altered or modified signal transduction occurs. These results are in agreement with the postulated function of IAP proteins in controlling the stability of CPD. It remains to be resolved whether IAP2 is involved in direct regulation of CPD or other components of brassinosteroid signal transduction pathway. The reverse-genetic analysis of five OBP genes did not lead to a typical steroid deficient phenotype. Analysis of the OBP gene family indicates functional redundancy, similar to that observed for the homologous yeast OSH proteins. The analysis of double mutants of the CPD interaction partners will yield a better picture of their function. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Lafos, Marcel MLafos@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16680
Date:	2006
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Brassinosteroidbiosynthese - cpd Mutante - Steroidtransport - pflanzliches Oxysterol bindendes Protein OBP - TDNA Insertionsmutanten German brassinosteroid biosynthesis - cpd mutant - steroid transport - plant oxysterol binding protein OBP - TDNA insertion mutants English
Date of oral exam:	11 January 2006
Referee:	Name Academic Title Coupland, George Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1668