Universität zu Köln

Betsuyaku, Shigeyuki (2005). Molecular dissection of Arabidopsis RAR1 and SGT1 functions in plant immunity. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Plants possess several layers of defence against pathogens. RAR1 (required for Ml-a12 conditioned resistance) and SGT1 (suppressor of G2 allele of skp1) are regulators of disease resistance conditioned by Resistance (R) proteins that recognise specific pathogen effectors. The model plant, Arabidopsis thaliana, has one copy of RAR1 (AtRAR1) and two recently duplicated copies of SGT1 (AtSGT1a and AtSGT1b). Despite their high sequence homology (78% identity at the amino acid level), AtSGT1b, but not AtSGT1a, is genetically recruited for resistance mediated by a subset of R proteins and for phytohormone signalling controlled by at least two plant SCF E3 ligases (SCF TIR1 and SCF COI1). AtRAR1, but not AtSGT1a or AtSGT1b, was also shown to contribute to plant basal defence against virulent pathogens, in which Arabidopsis EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility 1) is an essential regulator. Recent studies revealed roles of RAR1 as co-chaperones of HSP90 to promote accumulation of pre-activated R proteins. SGT1 also shares molecular features of known cochaperones. SGT1 from plant, yeast and human interact with HSP90 and, in human and yeast, is an assembly factor in kinetocore complex formation. The precise role of SGT1 in plant defence was unclear. Recent biochemical experiments showed that SGT1 is required for Bs2 R protein folding that implies SGT1 activity in R protein complex assembly. However, recent genetic data in Arabidopsis suggested that SGT1 acts antagonistically with RAR1 in R protein accumulation, suggesting of a role of SGT1 in R protein degradation. The presence of an additional copy of SGT1 in Arabidopsis and lethality of the sgt1a/sgt1b double mutant complicates genetic interpretation using this system. This study aimed to characterize further the activities of RAR1 and SGT1 in plant immunity using various approaches. Several pieces of key data on the activities of RAR1 and SGT1 in plant immunity were generated in this study. AtRAR1, AtSGT1a and AtSGT1b proteins were expressed in all tissue tested and, although direct interaction between these proteins was not found, Hsc70 was identified as a potential interacting partner of AtRAR1. AtRAR1 regulates AtSGT1b accumulation in the nucleus. I established that both AtSGT1b and AtSGT1a are capable of functioning in R protein-mediated defence and phytohormone signalling in a dose-dependent manner. Lower levels of AtSGT1a in plant cells are likely insufficient to show a genetic effect on sgt1a mutants due to the presence of the more abundant AtSGT1b. The finding of AtSGT1a activity prompts us to reconsider the current model of RAR1/SGT1 antagonism in defence based on purely genetic data using Arabidopsis. I found that AtRAR1 and AtSGT1b contribute to basal defence. Intriguingly, the rar1 and sgt1b mutants lower EDS1 protein accumulation and change the molecular character of EDS1. The activities of AtRAR1 and AtSGT1b in basal defence may be through EDS1. EDS1 is an indispensable regulator of resistance conditioned by the TIR (Toll-Interleukin-1 Receptor) class of nucleotide-binding/leucine-rich-repeat (NB-LRR) R protein. These data therefore suggest a potential molecular link between EDS1 and TIR-NB-LRR via RAR and SGT1. My results highlight the need for further analysis to dissect mechanisms of TIR-NBLRR protein assembly and activation and their molecular connection with EDS1 and the chaperone/cochaperone machinery.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Pflanzen besitzen diverse Abwehrmechanismen gegenüber Phytopathogenen. Die rassenspezifische Resistenz beruht auf Erkennung von Effektorproteinen des Pathogens durch pflanzliche Resistenz (R) Proteine. Mutationen in RAR1 (required for Ml-a 12 conditioned resistance)undSGT1 (suppressor of G2 allele of skp1) schwächen die R Protein-vermittelte Resistenz im Falle einiger jedoch nicht aller R Proteine. Das Genom der Modellpflanze Arabidopsis weist ein Ortholog des RAR1 Gens (AtRAR1) sowie zwei Kopien von SGT1 (AtSGT1a und AtSGT1b) auf. Obwohl AtSGT1a und AtSGT1b eine zu 78% identische Aminosäuresequenz besitzen, spielt nur das AtSGT1b Gen eine Rolle in der R Protein-vermittelten Krankheitsresistenz. AtSGT1b jedoch nicht AtSGT1a ist außerdem essentiell für mindestens zwei Phytohormon-Signaltransduktionswege, die durch SCF E3 Ubiquitinligasen (SCF TIR1 and SCFCOI1) kontrolliert werden. Hingegen trägt AtRAR1 aber nicht AtSGT1a oder AtSGT1b zur EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility 1)-abhängigen basalen Resistenz von Arabidopsis gegenüber virulenten Pathogenen bei. Biochemische Analysen legen nahe, dass RAR1 als Co-Chaperon des Hitzeschockproteins HSP90 fungiert, da Nullmutanten in den entsprechenden Genen eine deutlich reduzierte Akkumulation von R Proteinen zur Folge haben. Auch die Aminosäuresequenz von SGT1 beinhaltet CoChaperon-typische Domänen. SGT1 Proteine aus Pflanze, Mensch und Hefe interagieren mit HSP90 und sind in Hefe und menschlichen Zellen essentiell für die Bildung des Kinetochorkomplexes. Die Funktion von SGT1 in der R Protein-vermittelten Resistenz ist nicht bekannt. Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen, dass die Stabiltät des Bs2 R Proteins aus Tabak SGT1-abhängig ist, und deuten daher auf eine Funktion von SGT1 in der Stabilisierung und Akkumulation von R Proteinen hin. Genetische Analysen in Arabidopsis implizieren hingegen eine Rolle von SGT1 im Abbau von R Proteinen - also eine antagonistische Funktion zu RAR1. In Arabidopsis werden genetische Studien der Rolle von SGT1 jedoch durch die Duplikation des SGT1 Gens sowie die Lethalität der sgt1a/sgt1b Doppelmutante erschwert. Ziel dieser Arbeit war eine genauere Analyse der Funktionen von RAR1 und SGT1 auf genetischer und biochemischer Ebene. Die durchgeführten Versuche führten zu einem besseren Verständnis der Funktionen von RAR1 und SGT1 in der pflanzlichen Pathogenabwehr. Die Transkripte von AtRAR1, AtSGT1a und SGT1b sowie die codierten Proteine konnten in allen untersuchten Pflanzengeweben nachgewiesen werden. Es wurden keine Hinweise auf eine direkte Interaktion zwischen RAR1 und SGT1a oder SGT1b auf Proteinebene gefunden. Jedoch konnte eine Isoform des Hitzeschockproteins Hsc70 als potentieller Bindungspartner von AtRAR1 identifiziert werden. Außerdem wurde ein bislang nicht bekannter Einfluss von AtRAR1 auf die AtSGT1 Proteinakkumulation im Zellkern entdeckt. In dieser Arbeit konnte ferner gezeigt werden, dass sowohl SGT1a als auch SGT1b eine Funktion in der R Protein-vermittelten Resistenz haben. Untersuchungen auf Proteinebene zeigten, dass nicht die Primärsequenz von SGT1a und SGT1b sondern vielmehr die Proteinabundanz kritisch für eine Funktion in der Abwehrreaktion ist. Eine vergleichbare Konzentrationsabhängigkeit von SGT1a und SGT1b konnte für die Funktion in SCF E3 Ubiquitinligase-abhängigen Phytohormon-Signalwegen nachgewiesen werden. Da SGT1a in der Pflanze in geringeren Konzentrationen als SGT1b vorliegt, könnte dies die Abhängigkeit der R Protein-vermittelten Resisitenz sowie der Phytohormon-Signalketten von SGT1b erklären. Die konzentrationsabhängige Funktion von AtSGT1a verlangt nach einer Neubewertung der genetischen Analysen, die eine antagonistische Rolle von RAR1/SGT1 in der R Protein-vermittelten Resistenz von Arabidopsis postulieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass AtRAR1 und AtSGT1b zur basalen Resistenz beitragen. Sowohl rar1 als auch sgt1b Mutanten weisen im Vergleich zum Wildtyp reduzierte EDS1 Proteinmengen auf, außerdem zeigt EDS1 in diesen Mutanten veränderte molekulare Eigenschaften. EDS1 ist ein zentraler Regulator der Resistenz, die durch die TIR-NB-LRR (Toll-Interleukin-1 receptor / nucleotide binding site / leucine-rich repeat) Untergruppe von R Proteinen vermittelt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf eine molekulare Verbindung zwischen TIR-NB-LRR R Proteinen und EDS1 hin, die durch RAR1 und SGT1 beeinflusst wird. Weitere biochemische Analysen zum Faltungs- und Akkumulationsprozess von TIR-NB-LRR R Proteinen sind nötig, um die molekulare Verbindung zu EDS1 und die Rolle der Co-Chaperone/Chaperone in diesem Ablauf zu verstehen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Betsuyaku, Shigeyuki betsu@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16711
Date:	2005
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Arabidopsis, plant immunity, RAR1, SGT1, chaperone English
Date of oral exam:	7 December 2005
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1671