Universität zu Köln

D'silva, Michael Aloysius (2006). Characterization of the Ubiquitin-Protein Ligase E6-AP by RNA Interference. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The cellular ubiquitin-protein ligase E6-AP was initially identified as a protein that interacts with the E6 oncoprotein of Human papillomaviruses (HPVs) associated with cervical carcinomas. Subsequently, this E6/E6-AP complex has been shown to bind and target the tumour suppressor protein p53 for ubiquitin-mediated proteasomal degradation. In addition to p53, the E6/E6-AP complex also targets other cellular proteins for ubiquitin-mediated proteasomal degradation. However, the significance of these interactions in cervical carcinogenesis remains unclear. In contrast to most cancers wherein the p53 gene is mutated or not expressed, it is rarely mutated in HPV-positive cervical carcinomas. This has led to the assumption that functional inactivation of p53 by the E6/E6-AP complex is equivalent to its inactivation by mutation. To understand the significance of E6-AP for the viability of HPV-positive cells, in this study, E6-AP expression was down-regulated by RNA interference (RNAi) in HPV-positive cervical cancer cell lines. This resulted in p53 accumulation and growth suppression. Furthermore, HeLa cells, in which p53 expression was stably suppressed by RNAi, were found to be significantly less sensitive to the down regulation of E6-AP expression with respect to growth suppression than parental HeLa cells. These data indicate that E6-AP has anti-growth-suppressive properties in HPV-positive cells and that these depend on its ability to induce p53 degradation. Mutations within the E6-AP locus (UBE3A) resulting in functional inactivation of E6-AP have been associated with Angelman syndrome, an inherited human neurological disorder. To further elucidate the importance of E6-AP for the viability of HPV-negative cells, E6-AP was down-regulated by RNAi either transiently or stably in HPV-negative tumour cell lines. In contrast to HPV-positive cell lines, it was possible to obtain clonal HPV-negative cell lines in which E6-AP was stably down-regulated by RNAi. This would indicate that under the given conditions, HPV-negative cells are less sensitive to E6-AP down-regulation than HPV-positive cells. However, the inability to obtain clonal cell lines in which E6-AP expression is completely abrogated supports the hypothesis that certain threshold levels of E6-AP expression is essential for normal cell viability. Taken together, these results suggest that in comparison to HPV-positive cells, HPV-negative cells require lower threshold levels of E6-AP expression for viability and thus selective targeting of E6-AP function may have therapeutic potential against HPV-induced cervical carcinogenesis.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Charakterisierung der Ubiquitin-Protein Ligase E6-AP durch RNA interferenz German
Translated abstract:	Abstract Language Die Ubiquitin-Proteinligase E6-AP wurde ursprünglich als ein Protein identifiziert, das mit dem E6-Onkoprotein humaner Papillomaviren (HPVs) interagieren kann. Bestimmte HPVs spielen bei der Entstehung des Cervixcarcinoms eine kausale Rolle. Dabei bindet der E6/E6-AP Komplex an das Tumorsuppressorprotein p53 und führt so zu dessen Ubiquitinierung und anschließendem proteasomalen Abbau. Außer p53 werden weitere zelluläre Proteine E6/E6-AP-abhängig ubiquitiniert und abgebaut. Die Rolle dieser Interaktionen für die Cervixcarcinogenese ist aber noch unklar. Im Gegensatz zu den meisten Krebsarten, bei denen p53 entweder mutiert vorliegt oder überhaupt nicht exprimiert wird, wird in HPV-positiven Cervixcarcinomen Wildtyp-p53 exprimiert. Dies lässt die Annahme zu, dass eine funktionelle Inaktivierung von p53 durch E6/E6-AP mit einer Inaktivierung durch Mutation gleichgesetzt werden kann. Um die Bedeutung von E6-AP für die Lebensfähigkeit HPV-positiver Krebszellen zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit die Methode der RNA-Interferenz angewandt, um die Expression von E6-AP spezifisch abzuschalten. Suppression der E6-AP-Expression resultierte in der Akkumulation von p53 und einer Wachstumsinhibition der behandelten Zellen. Des Weiteren reagierten HeLa-Zellen, in denen die Expression von p53 durch RNA-Interferenz stabil reprimiert ist, signifikant weniger sensitiv auf eine Inhibition der E6-AP-Expression als parentale HeLa Zellen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die für das Wachstum HPV-positiver Zellen notwendige Aktivität von E6-AP auf seiner Eigenschaft basiert, im Komplex mit E6 p53 zu ubiquitinieren und somit zu dessen Abbau zu führen. Mutationen im E6-AP Locus (UBE3A), die in einer funktionellen Inaktivierung von E6-AP resultieren, sind für eine erbliche neurologische Erkrankung, dem Angelman-Syndrom, verantwortlich. Um die Bedeutung von E6-AP für die Lebensfähigkeit von HPV-negativen Zellen zu untersuchen, wurde die E6-AP-Expression durch RNA-Interferenz entweder transient oder stabil reprimiert. Die Tatsache, dass es im Gegensatz zu HPV-positiven Zellen möglich war, die E6-AP-Expression stabil zu reprimieren, lässt den Schluss zu, dass unter den gegebenen Bedingungen HPV-negative Zellen weniger sensitiv auf eine Unterdrückung der E6-AP-Expression reagieren als HPV-positive Zellen. Allerdings war es nicht möglich, klonale Zelllinien zu erhalten, in denen die E6-AP-Expression vollständig abgeschaltet war. Dies unterstützt die Hypothese, dass auch für die Lebensfähigkeit HPV-negativer Zellen eine bestimmte Menge an E6-AP essenziell ist. Nichtsdestotrotz scheint für die Lebensfähigkeit HPV-negativer Zellen ein deutlich niedrigerer Level an E6-AP ausreichend zu sein als für HPV-positive Zellen. Daher mag E6-AP ein potenzielles Zielprotein für die Therapie von HPV-positiven Cervixcarcinomen sein. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code D'silva, Michael Aloysius mail_mikee@yahoo.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16834
Date:	2006
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Ubiquitin Protein Ligase, HPV, E6-AP German Ubiquitin Protein Ligase, HPV, E6-AP English
Date of oral exam:	21 February 2006
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1683