Rho GTPasen der RhoBTB Familie: Charakterisierung und Rolle in der Tumorentstehung

Berthold, Jessica (2006). Rho GTPasen der RhoBTB Familie: Charakterisierung und Rolle in der Tumorentstehung. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Rho Proteine sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse wie Vesikeltransport, Morphogenese, Mikrotubuli-Organisation, Zytokinese, Genexpression, Zellzyklus-Progression, Apoptose und Tumorigenese beteiligt. Alle Mitglieder agieren als molekulare Schalter, indem sie zwischen einem aktiven GTP-gebundenen und einem inaktiven GDP-gebundenen Status wechseln. Eine Subfamilie der Rho GTPasen, die RhoBTB, wird in Vertebraten durch drei Isoformen repräsentiert. Sie umfassen ca. 600 Aminosäuren und werden durch eine GTPase Domäne, eine prolinreiche Region, einem Tandem von zwei BTB Domänen und einem Carboxylterminus von unbekannter Funktion charakterisiert. In situ-Hybridisierungen zeigten, dass RHOBTB1 und RHOBTB3 spezifisch in Endothelzellen und Spermatiden exprimiert werden, was auf eine Funktion in Entwicklungsprozessen wie der Angiogenese und Spermatogenese hindeutet. Veröffentlichungen zeigten, dass BTB Domänen an der Ausbildung von Cullin3-abhängigen Ubiquitin Ligasen beteiligt sind. Zudem werden RhoBTB2/DBC2 und RhoBTB1 als Kandidaten für Tumorsuppressorgenen diskutiert. Das Ziel dieser Arbeit ist die Rolle der RhoBTB Proteine in der Tumorentstehung zu entschlüsseln und die Signalwege aufzudecken, in die sie involviert sind. Zunächst haben wir die Bindung der RhoBTB Proteine mit Cullinen bewiesen. Hefe Hybrid-Analysen zeigten Interaktionen mit RhoBTB2 sowie dem C-terminalen Bereich (B1B2C) von RhoBTB3 mit Cullin3 und Cullin5 durch das Tandem der BTB Domänen. Die Bindung mit RhoBTB konnte hierbei auf die ersten 41 Aminosäuren von Cullin3 begrenzt werden. Mit Koimmunpräzipitations-experimenten wurde die Bindung bestätigt und weiterhin gezeigt, dass die erste BTB Domäne von RhoBTB3 mit Cullin3 interagiert. Auf die gleiche Weise wurde Homodimerisierung von RhoBTB3 und interessanterweise Heterodimerisierung von RhoBTB3 mit RhoBTB2 durch die BTB Domänen gezeigt. Ein ganz neuer Aspekt war die Interaktion der GTPase Domäne von RhoBTB2 sowie RhoBTB3 mit den BTB Domänen. Wir postulieren, dass diese intramolekulare Interaktion der GTPase Domäne und der BTB Domäne die regulatorische Funktion übernimmt. Die Bindung könnte die Dimerisierung, die möglicherweise für die Formation von Cullin3 Komplexen und Substraten mit RhoBTB Proteinen nötig ist unterbinden. RhoBTB3 zeigte auch eine Interaktion mit Ubiquitin-konjugierenden Enzym E2, welches die Ubiquitinkette auf die Substrate überträgt. Neben den noch unbekannten Substraten wird RhoBTB3 selbst im Proteasom abgebaut. Zur Entschlüsselung der Rolle in der Tumorentstehung wurden Expressionsmuster von RHOBTB und CUL Genen mit Hilfe eines cancer profiling arrays und cancer cell line profiling array analysiert. RHOBTB zeigte in allen Nierenproben und in 80% der Brustproben niedrigere Expression in tumoralen Geweben als in normalen Geweben. Es bestehen hohe Korrelationen in der Änderung der Expressionslevel zwischen RHOBTB3 und CUL3, was auf eine Ko-Regulation der Proteine hindeutet. Untersuchungen der subzellulären Lokalisation zeigten für alle drei Isoformen eine Expression als punktförmige Struktur um den Nukleus. In diesem Bereich kolokalisieren die RhoBTB Proteine mit allen Cullinen und lassen eine große Komplexbildung in Aggregaten vermuten. Wir postulieren ein Modell, in dem RhoBTB Proteine durch Formation von Cullin Komplexen zum Abbau spezifischer Substrate führen und die Suppression der RhoBTB Proteine zur Anreicherung der Substrate und Zellproliferation führt.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Rho GTPases of the RhoBTB familiy: characterization and role in tumorigenesis	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Rho proteins have been implicated mainly in the regulation of the cytoskeleton, but also in vesicle trafficking, phagocytose and transcriptional activation. They also participate in tumorigenesis, where some of them are overfunctional. A subfamily of Rho GTPases, RhoBTB proteins, is represented by three isoforms in vertebrates: RhoBTB1, RhoBTB2 and RhoBTB3. They are around 600 amino acids long and consist of a GTPase domain, a proline-rich region, two BTB domains and a carboxyl-terminal region of unknown function. In situ-hybridisation studies of RHOBTB1 and RHOBTB3 yielded specific expression in endothelial cells and spermatides, suggesting a function in developmental processes like angiogenesis and spermatogenesis. Recent reports demonstrate that BTB domains are involved in the formation of cullin3-dependent ubiquitin ligase complexes. In addition, RHOBTB2/DBC2 and RHOBTB1 have been proposed as candidates for tumor suppressor genes. The aim of this thesis is to identify the role of RhoBTB proteins in oncogenesis and to uncover the signal transduction pathways in which these proteins are involved. First we examined the binding of RhoBTB proteins to cullins. Two hybrid experiments yielded interaction between RhoBTB2 and the C-terminal part of RhoBTB3 with cullin3 and cullin5 through both BTB domains. The binding of cullin3 is restricted to to the first 41 amino acids. We confirmed this finding in vivo by coimmunoprecipitation studies and could further show, that the first BTB domain of RhoBTB2 is responsible for this interaction. Using a similar approach we also showed dimerization of RhoBTB3 and interestingly heterodimerization of RhoBTB3 and RhoBTB3 through the BTB domains. It turned out that the GTPase domain is able to interact with the BTB domains. We propose a model in which masking of the targeting function of the BTB domain for interaction with cullin3 complexes and/or substrates is mediated by the intramolecular interaction between the catalytic GTPase domain and the BTB domains. Furthermore, RhoBTB3 interacts with the ubiquitin-conjugating enzyme E2 that transfers the ubiquitin chain to a specific substrate. In addition to unidentified substrates, RhoBTB3 might also be itself degraded in the proteasome. To address the role of RhoBTB in tumorigenesis we analysed the expression profile of RHOBTB genes using a cancer profiling array and a cancer cell line profiling array. We observed a decrease in RhoBTB expression in all kidney tumor samples and about 80% of breast samples versus the matched normal tissue. High correlation exists in the expression changes of RHOBTB3 and CUL3 suggesting that these genes are co-regulated. Subcellular localization studies of all RhoBTB isoforms showed speckled dots around the nucleus where also cullins colocalize, probably in large complexes. We envision a model in which RhoBTB proteins target specific substrates for degradation by formation of cullin complexes and suppression of RhoBTBs results in accumulation of the target followed by cell proliferation.

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