Genetic dissection of regulatory domains and signalling interactions of PRL1 WD-protein in Arabidopsis

Szakonyi, Dóra (2006). Genetic dissection of regulatory domains and signalling interactions of PRL1 WD-protein in Arabidopsis. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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The Arabidopsis PLEIOTROPIC REGULATORY LOCUS 1 (PRL1) encodes a nuclear WD40 protein. Plants carrying a prl1 insertion mutation are smaller than wild type, have shorter roots, leaves with serrated leaf margins and shorter petioles. In photosynthetic tissues of the prl1 mutant elevated glucose, sucrose, fructose, starch, anthocyanin and chlorophyll levels are detected. Loss of the PRL1 function results in hypersensitivity to glucose, sucrose and plant hormones, including cytokinin, ethylene, abscisic acid and auxin. To study the regulatory function of PRL1, we first developed molecular tools for characterization of PRL1 gene expression. A full length (4.2 kb) PRL1 promoter driving the expression of β-glucuronidase (GUS) reporter gene in fusion with coding sequences for the first 69 amino acids of PRL1 protein was found to be expressed in most tissues. To identify regulatory regions in the PRL1 gene, a set of promoter deletions was generated and propagated in cell suspension and in planta. Our results demonstrated that intragenic sequences are crucial for correct gene expression as PRL1 constructs lacking the second intron showed only low activity. A short promoter containing an alternative TATA-box, 5�-UTR and 0.5 kb coding region with the first two introns of PRL1 showed GUS activity similar to the previously characterized full-length promoter. Whereas upstream regulatory sequences (~3.5 kb) alone were not sufficient for correct mRNA expression, constructs containing the second intron proved to be fully functional in genetic complementation assays in the prl1 mutant background. Sequence analysis suggested the importance of a TC-rich region in the second intron. However, deletion of this sequence did not affect gene expression dramatically. When PRL1 was tagged with green fluorescent protein (GFP), it was found to be expressed in most cell types and localized mainly in the nucleus. To differentiate the role of PRL1 protein in organ development, a PRL1 genomic fragment and cDNA were misexpressed using the heterologous promoters of AtKNAT1; AtSTM; AtUFO; AtAS1; AtSUC2, At4CL1 and TobRB7 genes. Whereas genomic constructs complemented the prl1 phenotype in all cases, only cDNA construct driven by the AtAS1 and AtSUC2 promoters were able to complement the prl1 mutant leaf phenotype. Posttranslational regulation for PRL1 was suggested by our result indicating that the protein is unstable. The reversible proteasome inhibitor MG132 stabilized PRL1 suggesting that PRL1 is degraded in a proteasome-dependent manner. In the N-terminal region of PRL1, a destruction box (D box) motif was identified, which represents a putative degron for the Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC) E3 ligase complex. Point mutations were introduced to disrupt the D box consensus sequence, in order to stabilize PRL1 protein. In cell suspension higher level of GFP-tagged PRL1 protein could be detected as potential result of stabilizing mutations, but this was not the case in three-week-old seedlings. Therefore, full understanding the control of PRL1 degradation requires further investigations. Biochemical studies revealed that PRL1 is present in a large nuclear protein complex associated with the spliceosome component AtCDC5 protein. Our data indicate that AtCDC5 interacts with various elements of the protein degradation system, such as the 20S core and 19S lid particles of the proteasome, the CSN5 subunit of the COP9 signalosome and the SCF E3 ubiqutin ligase subunit CULLIN 1. In addition, ubiquitinated proteins were detected in pull-down assays with AtCDC5 suggesting that substrates targeted to the proteasome are potentially also associated to this complex. These results indicate potential roles for PRL1 through its interaction with AtCDC5 in mRNA splicing and proteasome-dependent protein degradation. Ongoing projects aim at further understanding of the PRL1 function using genetic and site-specific mutagenesis approaches.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Der Arabidopsis PLEITROPIC LOCUS (PRL1) kodiert für ein nukleares WD40-Protein. Pflanzen, die eine PRL1-Insertionsmutation tragen, sind kleiner als der Wildtyp, haben kürzere Wurzeln, Blätter mit gesägten Blatträndern und kürzere Petiolen. In photosynthetisch aktiven Geweben der prl1-Mutante lassen sich erhöhte Mengen an Glukose, Saccharose, Fruktose, Stärke, Anthozyanin und Chlorophyll nachweisen. Der Verlust der PRL1-Funktion führt zur Hypersensitivität gegenüber Glukose, Saccharose und Pflanzenhormonen, einschliesslich Cytokinin, Ethylen, Abscisinsäure und Auxin. Für die Analyse der regulatorischen Funktion von PRL1 entwickelten wir zunächst molekulare Werkzeuge um die PRL1-Genexpression zu charakterisieren. Ein Volllängen- (4.2 kb) PRL1-Promotor, der die Expression des β-Glukuronidase (GUS)-Reportergens als Fusion mit den ersten 69 Aminosäuren der kodierenden Sequenz des PRL1-Proteins steuert, liess sich in den meisten Geweben als exprimiert beobachten. Zur Identifizierung der regulatorischen Bereiche des PRL1-Gens wurde eine Anzahl von Promotordeletionen erzeugt und sowohl in Gewebekultur als auch in planta propagiert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass intergenische Regionen entscheidend für eine korrekte Genexpression sind, da PRL1-Konstrukte, denen das zweite Intron fehlt, nur eine geringe Aktivität aufweisen. Ein kurzer Promotor, der eine alternative TATA-Box, 5´-UTR und einen 0.5 kb grossen kodierenden Bereich einschliesslich der ersten beiden Introns von PRL1 enthält, zeigt eine GUS-Aktivität ähnlich der des zuvor charakterisierten Volllängenpromotors. Während stromaufwärts gelegene regulatorische Sequenzen (~ 3.5 kb) allein nicht für eine korrekte mRNA-Expression ausreichend sind, konnten Konstrukte die das zweite Intron tragen, in genetischen Komplementationsversuchen vor dem prl1-Mutantenhintergrund als funktional nachgewiesen werden. Die Sequenzanalyse legte die Bedeutung einer TC-reichen Region im zweiten Intron nahe. Die Deletion dieser Region führte jedoch nicht zu einer dramatischen Veränderung der Genexpression. Als PRL1 mit dem grünen fluoreszierenden Protein (GFP) markiert wurde, ließ es sich in den meisten Zelltypen als exprimiert und hauptsächlich als im Nukleus lokalisiert nachweisen. Zur Unterscheidung der Rolle des PRL1-Proteins in der Organentwicklung, wurden ein genomisches PRL1-Fragment und die cDNA hinter den heterologen Promotoren der AtKNAT1; AtSTM; AtUFO; AtAS1; AtSUC2 und TobRB7 Gene exprimiert. Während die genomischen Konstrukte in allen Fällen den prl1-Phänotyp komplementierten, konnten nur cDNA-Konstrukte, die von den AtAS- und AtSUC2-Promotoren angetrieben werden, den Blattphänotyp der prl1-Mutante komplementieren. Aufgrund unseres Befundes, dass das Protein instabil ist, wurde eine posttranslationale Regulation für PRL1 postuliert. Der reversible Proteasominhibitor MG132 stabilisiert PRL1 und so liegt die Vermutung nahe, dass PRL1 in einer Proteasom-abhängigen Weise abgebaut wird. Im N-terminalen Bereich von PRL1 konnte ein Zerstörungs- (destruction, D-) Boxmotiv identifiziert werden, welches ein mögliches Degron für den �Anaphase Promoting Complex / Cyclosome E3 Ligase (APC) Komplex� darstellt. Entsprechende Punktmutationen wurden eingeführt um die D-Box-Konsensussequenz zu unterbrechen, mit der Zielsetzung so das PRL1-Protein zu stabilisieren. In Zellsuspension konnte ein höheres Niveau von GFP-markiertem PRL1-Protein als mögliches Ergebnis der stabilisierenden Mutationen nachgewiesen werden, aber in drei Wochen alten Keimlingen war dies nicht der Fall. Aus diesem Grund sind weitere Untersuchungen für ein volles Verständnis der Kontrolle des PRL1-Abbaus erforderlich. Biochemische Studien belegten die Anwesenheit von PRL1 in einem grossen nuklearen Proteinkomplex assoziiert mit dem Spliceosomkomponenten AtCDC5 Protein. Unsere Daten zeigen, dass AtCDC5 mit verschiedenen Komponenten des Proteindegradationssystems interagiert, wie z.B. mit den 20S Kern- und den 19S Deckelpartikeln des Proteasoms, der CSN5 Untereinheit des COP9-Signalosoms und der SCF E3-Ubiquitinligaseuntereinheit Cullin1. Ausserdem lassen sich ubiquitinylierte Proteine in �pull-down� Versuchen mit AtCDC5 nachweisen, was vermuten lässt, dass Substrate, die für das Proteasom bestimmt sind, möglicherweise mit diesem Komplex assoziiert sind. Diese Ergebnisse deuten aufgrund seiner Interaktion mit AtCDC5 auf mögliche Rollen für PRL1 beim mRNA-Spleissen und beim Proteasom-abhängigen Proteinabbau hin. Fortlaufende Projekte mit der Zielsetzung eines erweiterten Verständnisses der PRL1-Funktion bedienen sich genetischer Ansätze und ortspezifischer Mutagenese.

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