Universität zu Köln

Stephen, Sam Laurel (2007). Chromosomal integration in vitro and in vivo of high capacity adenoviral vectors. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Gene therapy trials using adenoviral vectors for gene delivery are currently underway. A clinical trial based on retrovirus-mediated gene transfer resulted in the development of leukaemia in some of the subjects due to insertional mutagenesis. This experience highlights the importance of an evaluation of the biosafety of gene transfer vectors prior to their use in humans. The overall aim of this research was to quantitatively and qualitatively analyse recombination between vector DNA and chromosomal DNA in vitro and in vivo following HC-Ad vector-mediated gene transfer. To study the rates, at which HC-AdV DNA underwent homologous recombination with chromosomal DNA following gene transfer in vitro, the Hprt model, a classical system in recombination studies, was utilized. A vector was designed to target exon 2 of the human Hprt gene by introducing a stop codon upon homologous recombination. In these experiments, which were performed in primary cells and in established cell lines, the frequency of homologous recombination of the HC-AdV DNA with the HPRT locus was found to be, depending on the cell type, between 2x10-5 to 1.2x10-6. In a different set of experiments and using a selection marker strategy, the rate at which HC-AdV DNA integrated randomly into the chromosomal DNA was determined to be between 5.4x10-3 to 1.1x10-4. To more closely mimic the situation following therapeutic gene transfer, in vivo experiments were performed. The use of the FahDexon 5 knockout model allowed to study homologous and heterologous recombination events following in vivo gene transfer to the liver. Correction of the pathological phenotype was achieved either by targeting exon 5 with an HC-AdV carrying a 12.3 kb targeting sequence (homologous recombination) or by measuring integration frequencies following gene transfer with an HC-AdV expressing the FAH cDNA (heterologous recombination). The targeting frequency of exon 5 was estimated to be 5.6x10-7, and the rate of random integration was found to be 4x10-5. This study is the first to document evidence of recombination between HC-AdV DNA and chromosomal DNA in vivo. The analysis of the vector integrates following transduction of primary cells and cell lines indicated that HC-AdV DNA integrated as an intact molecule and via the termini in most cases. About half of the vector DNA integrations took place inside genes and none were observed in protooncogenes. Analysis of the junction sequences suggested that the HC-AdV DNA had integrated in a random manner throughout the genome without an obvious preference for any particular chromosomal regions. Patchy homologies between the vector termini and the chromosomal DNA were observed at the site of integration. Though the majority of the integrations had occurred without causing any mutations in the chromosomal DNA, cases of substitutions and insertions of nucleotides too were observed. This study has established quantitative data on in vitro and in vivo recombination frequencies of adenoviral vector DNA with genomic DNA and has provided a molecular characterization of observed integration events. These results may contribute to a risk-benefit assessment of adenovirus-mediated gene transfer.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Analyse von Rekombinationsereignissen zwischen Vektor und chromosomaler DNA in vitro und in vivo nach HC-Ad Vektor-vermitteltem Gentransfer German
Translated abstract:	Abstract Language Gentherapieversuche mit adenoviralen Vektoren befinden sich zurzeit in der klinischen Testphase. Nach Retrovirus-vermitteltem Gentransfer kam es bei einigen Probanden durch Insertionsmutagenese zur Entstehung von Leukämien. Diese Erfahrung unterstreicht die Bedeutung präklinischer Untersuchungen zur biologischen Sicherheit von Gentransfervektoren. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die quantitative und qualitative Analyse von Rekombinationsereignissen zwischen Vektor und chromosomaler DNA in vitro und in vivo nach HC-Ad Vektor-vermitteltem Gentransfer. Zur Bestimmung der Häufigkeit homologer Rekombination zwischen HC-Ad Vektor DNA und chromosomaler DNA wurde das häufig in Rekombinationsstudien eingesetzte HPRT-Selektionsmodell verwendet. Ein adenoviraler Vektor wurde konstruiert, der das menschliche HPRT Gen durch Einführung eines Stop Codons in Exon 2 mittels homologer Rekombination inaktivierte. In primären Zellen und in etablierten Zellenlinien wurden zelltypabhängig Häufigkeiten homologer Rekombination zwischen 2x10-5 bis zu 1,2x10-6 ermittelt. Die Frequenz zufälliger Integrationsereignisse wurde durch HC-Ad Vektor-vermittelte Zelltransduktion unter Verwendung eines Selektionsmarkers ermittelt und lag innerhalb eines Bereiches von 5,4x10-3 und 1,1x10-4. Zur besseren Nachahmung der klinischen Situation wurden in vivo Experimente in der Labormaus durchgeführt. Die Verwendung des FahDexon 5 Modells erlaubte die Untersuchung homologer und heterologer Rekombinationsereignisse nach in vivo Lebergentransfer. Die Korrektur des pathologischen Phenotyps wurde erreicht entweder durch das Targeting von Exon 5 mit einem HC-Ad Vektor, der eine 12.3 kb Targetingsequenz trug (homologe Rekombination) oder durch Bestimmung der Integrationshäufigkeit nach Gentransfer mit einem die FAH cDNA exprimierenden HC-Ad Vektor (heterologe Rekombination). Die Targetinghäufigkeit des Exon 5 wurde mit 4,6x10-7 bestimmt, die Häufigkeit der zufälligen Integration mit 4x10-5. Dies ist die erste Untersuchung, die in vivo Rekombination zwischen HC-Ad Vektor DNA und chromosomaler DNA dokumentiert. Analyse der Vektorintegrate nach Transduktion von primären Zellen und von Zelllinien ergab, dass in den meisten Fällen die HC Ad-Vektor DNA als intaktes Molekül und über die viralen Enden integrierte. Ungefähr die Hälfte der Integrationsereignisse fand innerhalb von Genen statt. Keine Integration wurde in Protoonkogenen beobachtet. Die Analyse der Junktionssequenzen ergab, dass die HC-Ad Vektor DNA zufällig im Genom integrierte und ohne offensichtliche Präferenz für bestimme chromosomale Regionen. Am Ort der Integration wurden häufig Mikrohomologien zwischen den Vektorenden und der chromosomalen DNA beobachtet. Obwohl die meisten Integrationen nicht zu Mutationen in der chromosomalen DNA führten, wurden einige Fälle von Nukleotidsubstitutionen und Insertionen beobachtet. In dieser Untersuchung wurden quantitative Daten bezüglich der Häufigkeit von in vitro und in vivo Rekombination zwischen adenoviraler Vektor DNA und genomischer DNA erhoben und die Integrationsereignisse wurden auf molekularer Ebene charakterisiert. Diese Ergebnisse tragen zu einer Risiko-Nutzen Abwägung nach Adenovirus-vermitteltem Gentransfer bei. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Stephen, Sam Laurel sam_stephen@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19332
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > no entry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language adenoviralen vektoren, Insertionsmutagenese, biologischen Sicherheit von Gentransfervektoren, homologer Rekombination German adenoviral vectors, Insertional mutagenesis, bio safety of gene transfer vectors, homologous recombination English
Date of oral exam:	11 January 2007
Referee:	Name Academic Title Kochanek, Stefan Prof. Dr
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1933