Universität zu Köln

Sichtig, Nadine (2006). Charakterisierung des zellulären Proteins "Papillomavirus Binding Factor" PBF. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Regulation der Papillomvirus (PV)-Genexpression erfolgt über die Bindung von viralen und zellulären Proteinen an verschiedene cis-regulatorische Elemente innerhalb der nicht-kodierenden Region (NCR). Das bisher unbekannte zelluläre Protein PBF (Papillomavirus Binding Faktor) wurde über die Bindung an die Repression vermittelnden E2-Bindestellen (BS) P2 des humanen PV Typ8 (HPV8) und BS1 des bovinen PV Typ1 identifiziert. Darüber hinaus bindet es auch an regulatorische Sequenzen innerhalb des Huntigton�s Disease Gens. In Tumorgeweben wurde, im Vergleich zu normalen PBF-exprimierenden Geweben, eine gesteigerte Expression von PBF beobachtet. In Vorarbeiten konnten mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid Systems die Proteine 14-3-3ß und Sin3-assoziiertes Polypeptid p30 (SAP30) als Interaktionspartner von PBF charakterisiert werden. Ziel dieser Arbeit war, die Bedeutung der Wechselwirkungen von 14-3-3ß und SAP30 mit PBF zu untersuchen und dadurch mehr über seine Funktion in der Zelle sowie im Zusammenhang mit einer HPV-Infektion zu erfahren. Die Interaktionen von PBF mit 14-3-3 und SAP30 wurden sowohl in vitro in GST-Pulldown-Experimenten als auch in vivo durch Koimmunpräzipitationen bestätigt. Die Assoziation von PBF und 14-3-3, die auf das Cytoplasma begrenzt ist, erfolgt über eine hoch- und eine niedrig-affine BS. Die Bindung erfordert Phosphorylierungen der beiden BS, vermittelt durch die Akt Kinase und eine weitere PI3K-abhängige Kinase. Unter Serum Entzug wurde eine Translokation von PBF in den Zellkern beobachtet. Da eine 14-3-3-bindungsdefiziente PBF-Mutante effizienter in den Kern wanderte, trägt die Interaktion mit 14-3-3 zur Kontrolle der subzellulären Lokalisation von PBF bei. Zusätzlich spielen jedoch weitere Wachstumsfaktor-abhängige Regulationsmechanismen eine Rolle. Eine Überexpression von PBF resultierte in einer Inhibition des Zellwachstums, welche durch Reduktion bzw. Verlust der 14-3-3 Interaktion gesteigert wurde. In transienten Transfektionsanalysen wurde durch Überexpression von PBF eine Repression der Transkription beobachtet, die größtenteils von spezifischer DNA-Bindung abhängt und nach Verlust der 14-3-3-Bindung verstärkt war. Diese PBF-induzierte Promotorrepression wird vermutlich über die Interaktion mit SAP30 und der daraus resultierenden Assoziation mit dem mSin3-HDAC-Komplex vermittelt, da eine Inhibition von Deacetylase-Aktivitäten die Repression aufhob. Die DNA-Bindung von PBF, welche in vivo durch einen ChIP-Assay bestätigt wurde, erfolgt über zwei konservierte CRAR-Regionen. Diese Ergebnisse unterstützen das Model, dass der nukleäre Import von PBF, teilweise reguliert über die Phosphorylierung durch die Akt Kinase und die Interaktion mit 14-3-3, eine Repression der Expression von Zellwachstum-regulierenden Zielgenen zur Folge hat und somit einen Wachstumsstopp induziert. In Koimmunpräzipitationen wurde weiterhin eine Interaktion von PBF mit E6-Proteinen von HPV nachgewiesen. HPV8-E6 hob die PBF-vermittelte Wachstumsinhibition auf. Im Rahmen einer HPV-Infektion könnte somit das Onkoprotein E6 der wachstumshemmenden Funktion von PBF entgegenwirken, um einen erfolgreichen HPV-Lebenszyklus zu ermöglichen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Characterization of the cellular protein "Papillomavirus Binding Factor" PBF English
Translated abstract:	Abstract Language The papillomavirus (PV) gene expression is regulated by the binding of viral and cellular proteins to their cis-regulatory elements within the non-coding region (NCR). The so far unknown cellular protein PBF (Papillomavirus Binding Factor) was identified by the ability to bind to the repression mediating E2-binding sites (BS) of the human PV type 8 (HPV8) and the BS1 of the bovine PV type 1 and by the binding to regulatory sequences within the Huntington� Disease gene. Cancer tissues revealed higher expression levels of PBF in comparison to normal PBF expressing tissues. Previous work identified the proteins 14-3-3ß and Sin3-associated polypeptide p30 (SAP30) as interaction partners of PBF using the Yeast-Two-Hybrid system. The aim of this work was to study the relevance of the interactions of 14-3-3ß and SAP30 with PBF, respectively, with the aim to learn more about the function within the cell and in the course of the HPV infection. The interactions of PBF with 14-3-3 and SAP30 were confirmed in vitro in GST-pulldown experiments as well as in vivo by coimmunoprecipitations, respectively. The association of PBF with 14-3-3 was restricted to the cytoplasm and mediated by a high- and a low-affinity BS. The binding requires phosphorylation of both BS by the Akt kinase and another PI3K dependent kinase. Serum starvation led to translocation of PBF to the nucleus. Since the 14-3-3-binding-deficient PBF mutant was shifted to the nucleus more efficiently, the interaction with 14-3-3 may contribute to the control of the subcellular localisation of PBF. However, in addition, other growth factor regulated pathways may be involved. Over-expression of PBF resulted in an inhibition of cell growth, which was increased by reduction or loss of 14-3-3 interaction. Transient transfection studies revealed that PBF repressed transcription, which was dependent on sequence-specific DNA-binding and enhanced after loss of 14-3-3 binding. The inhibition of deacetylase activities abolished promoter repression by PBF, indicating that the PBF-induced promoter repression seems to be mediated by the interaction with SAP30, which is associated with the mSin3-HDAC complex. The sequence-specific binding of PBF to DNA was confirmed in vivo by a ChIP assay, and required two conserved CRAR-regions. These results are in line with the model, that the nuclear import of PBF is partly regulated via the interaction with 14-3-3, which requires previous phosphorylation by the Akt kinase. Nuclear PBF possibly represses the expression of cell growth regulating genes and leading to a stop of cell growth. Moreover, an interaction of PBF with E6 proteins of HPV was detected. HPV-8E6 abrogated the PBF-mediated growth inhibition. Thus, the oncoprotein E6 may counteract the growth inhibitory function of PBF to support a successful HPV life cycle. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Sichtig, Nadine nasichtig@freenet.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19466
Date:	2006
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Virologie > Institut für Virologie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language PBF, HPV, 14-3-3ß, Akt Kinase, SAP30, E6-Protein, Transkriptionsregulation, Zellwachstum German PBF, HPV, 14-3-3ß, Akt kinase, SAP30, E6-protein, regulation of transcription, cell growth English
Date of oral exam:	5 December 2006
Referee:	Name Academic Title Pfister, Herbert Prof. Dr. rer. nat. Dr. h.c.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1946