Universität zu Köln

Dertinger, Thomas (2007). Two-Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) has been invented more than 30 years ago and experienced a renaissance after stable and affordable laser sources and low-noise single-photon detectors have become available. Its ability to measure diffusion coefficients at nanomolar concentrations of analyte made it a widely used tool in biophysics. However, in recent years it has been shown by many authors that aberrational (e.g. astigmatism) and photophysical effects (e.g. optical saturation) may influence the result of an FCS experiment dramatically, so that a precise and reliable estimation of the diffusion coefficient is no longer possible. In this thesis, we report on the development, implementation, and application of a new and robust modification of FCS that we termed two-focus FCS (2fFCS) and which fulfils two requirements: (i) It introduces an external ruler into the measurement by generating two overlapping laser foci of precisely known and fixed distance. (ii) These two foci and corresponding detection regions are generated in such a way that the corresponding molecule detection functions (MDFs) are sufficiently well described by a simple two-parameter model yielding accurate diffusion coefficients when applied to 2fFCS data analysis. Both these properties enable us to measure absolute values of the diffusion coefficient with an accuracy of a few percent. Moreover, it will turn out that the new technique is robust against refractive index mismatch, coverslide thickness deviations, and optical saturation effects, which so often trouble conventional FCS measurements. This thesis deals mainly with the introduction of the new measurement scheme, 2fFCS, but also presents several applications with far-reaching importance.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) wurde vor mehr als 30 Jahren entwickelt und erfuhr durch die Entwicklung von stabilen und einfach handhabbaren Laserquellen sowie hocheffizienter Einzel-Photonen-Detektoren eine Renaissance. Die Faehigkeit, Diffusionskoeffizienten auch bei nanomolarer Probenkonzentration messen zu können, trug stark zur Verbreitung der FCS auf dem Gebiet der Biophysik bei. Die vergangenen Jahre haben jedoch gezeigt, dass sowohl optische Abberationen (z.B. Astigmatismus, Brechungsindex Abweichung) als auch photophysikalische Effekte (wie z.B. optische Saettigung) das Ergebnis eines FCS-Experimentes erheblich beeinflussen koennen, so dass eine zuverlaessige und genaue Bestimmung des Diffusionskoeffizienten nicht mehr moeglich ist. In der vorliegenden Arbeit berichten wir über die Entwicklung, Implementation und Anwendung einer neuartigen und robusten Modifikation herkoemmlicher FCS, die wir 2-Fokus-FCS (2fFCS) nennen und die zwei Voraussetzungen erfüllt: (i) es wird ein externer Maßstab in die Messung eingefuehrt, indem zwei lateral versetzte aber ueberlappende Laserfoki der gleiche Wellenlaenge in einem wohldefinierten Abstand generiert werden. (ii) Diese Foki und deren korrspondierende Molekuel-Detektions-Funktionen (MDF) koennen durch ein einfaches zwei-Parameter Modell ausreichend gut beschrieben werden. Diese beiden Eigenschaften ermoeglichen uns, Diffusionskoeffizienten mit hoechster Genauigkeit zu messen. Desweiteren zeigt sich, dass das neue Messprinzip robust ist gegenueber Brechungsindex-Abweichungen, optischer Saettigung oder Deckglassdicken-Schwankungen. Diese Arbeit befasst sich hauptsaechlich mit der Einfuehrung des neuen Messprinzips der 2fFCS, jedoch werden auch etliche Anwendungen von weitreichender Bedeutung vorgestellt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Dertinger, Thomas t.dertinger@fz-juelich.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-20357
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > Forschungszentrum Jülich
Subjects:	Physics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language single molecule spectroscopy , fluorescence correlation spectroscopy , diffusion , confocal microscope , hydrodynamic radius English
Date of oral exam:	18 April 2007
Referee:	Name Academic Title Enderlein, Jörg Priv. Doz. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2035