Universität zu Köln

Günter, Robert Heinz (2007). Der Glutamattransporter GLT-1 des zentralen Nervensystems. Zellbiologische und elektrophysiologische Untersuchungen zur Transportfunktion. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Der Glutamattransporter GLT-1 ist ein Transmembranprotein, das im ZNS überwiegend in Astrozyten lokalisiert ist. Seine Funktion als hochaffiner, Na+-abhängiger Transporter besteht in der Entfernung des Neurotansmitters Glutamat aus dem synaptischen Spalt. Dies ermöglicht eine getreue Signalweiterleitung und die Vermeidung von exzitatorischer Schädigung. Von den Glutamattransportern GLT-1 und den fluoreszierenden GLT-1 wie auch GLAST-1 und EAAC1, die am N-Terminus mit dem fluoreszierenden Polypeptid EGFP fusioniert sind, sind Konstrukte für die heterologe Expression in Xenopus laevis Oozyten und HEK293 Zellen (human embryonic kidney) erstellt worden. Die Untersuchungen dieser Arbeit belegen, daß GLT-1 als auch das Fusionsprotein während des Zell-targeting korrekt prozessiert und funktionell in die Plasmamembran eingebaut werden. Deshalb wurden die Konstrukte zur Charakterisierung von GLT-1 in Neurotransmitter Aufnahmestudien in GLT-1 transfizierten Xenopus laevis Oozyten und HEK293 Zellen mit radioaktiv markiertem L-[14C]-Glutamat, als auch in elektrophysiologischen whole-cell voltage- und patch-clamp Experimenten angewandt. Die Ionenspezifität für Na+-Ionen, KM-Werte von Glutamat und Na+-Ionen, die Kinetik der Glutamataufnahme und verschiedene Inhibitoren des GLT-1 Transporters wurden ermittelt. Die vorliegende Arbeit beschreibt zusätzlich den Einfluß von extrazellulären Ca2+-Ionen auf den Transport von Glutamat. Im Gegensatz zu Na+ wird Ca2+ nicht von GLT-1 transportiert, Ca2+-Ionen beeinflussen aber den Transport von L-Glutamat. Diese Beobachtungen erweitern unsere Kenntnisse über den Effekt von intrazellulärem Ca2+ hinaus auf die GluT Familie. Strukturanaloge Substrate des natürlichen Neurotransmitters Glutamat sind genauer klassifiziert worden. Zusätzlich zur endständigen geladenen Carboxylgruppe oder der SH-Gruppe in Liganden, konnte die essentielle Bedeutung der Aminogruppe in -Position � wie in L--Aminoadipat � für die Bindung des Liganden bewiesen werden. Ungeladene Aminosäuren oder -Aminosäuren, wie L--Aminoadipat, zeigen dagegen keinen Einfluß auf den Transport von L-Glutamat. Es wurde gezeigt, daß GLT-1, ähnlich wie GLAST-1, L-Aspartat transportieren kann.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language The Glutamatetransporter GLT-1 of the Central Nervous System - cell biological and electrophysiological analysis of the transport function English
Translated abstract:	Abstract Language Glutamate transporter GLT-1 is a transmembrane protein, which is mainly localized in astrocytes of the CNS. GLT-1 is a high affinity Na+ dependent transporter, which removes the neurotransmitter glutamate from the synaptical cleft, an essential process required for defined signal transduction and to avoid excitatory damage. Glutamate transporter GLT-1 and fluorescent GLT-1 as well as GLAST-1 and EAAC1, which contained the transporter-polypeptide fused to the fluorescent protein EGFP at the N-terminal end of the glutamate transporter were constructed for heterologous expression in Xenopus laevis oocytes and HEK293 (human embryonic kidney) cells. The experiments described here prove, that GLT-1 and likewise the fusionprotein are targeted during the cellular transport to and functionally incorporated into the the plasmamembrane. Therefore the fluorescent-labeled GLT-1 and likewise GLAST-1 and EAAC1, two other members of the glutamate transporter family, heterologously expressed in different cell system, like Xenopus oocytes and HEK293 cells, proved to be valuable tools for cell biological, biochemical and electrophysiological studies in the characterization of these excitatory glutamate transporters. Neurotransmitter uptake studies in GLT-1 transfected Xenopus oocytes and HEK293 cells used radioactive labeled L-[14C]-glutamate associated with the method of choice, the electrophysiological whole cell voltage- and patch-clamp experiment, were applied to the characterization of GLT-1. The ion specificity for Na+ ions, KM values of glutamate and Na+ ions, the kinetics of glutamate uptake and several inhibitors of the GLT-1 transporter were established. The present work also describes the influence of Ca2+ ions on glutamate transport. Unlike Na+, Ca2+ ions are not transported by GLT-1 but affect the transport of L-glutamate. These observations expand our view of the effect of intracellular Ca2+ on the GluT family. The structural requirements of ligands with structures analogous to the genuine neurotransmitter glutamate have been classified more exactly. In addition to the terminal charged carboxyl-group or the SH-group in ligands, the amino group in -position � as in L--aminoadipate - turned out to be essential for the binding properties of ligands. Uncharged amino acids or -amino acids, as L--aminoadipate, do not show any influence on the transport of L-glutamate. It is shown that GLT-1 has a similar ability to transport L-aspartat as GLAST-1. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Günter, Robert Heinz robert.guenter@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-20375
Date:	2007
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Laboratorium für Molekulare Neuroforschung
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language GLT-1 , voltage-clamp , ZNS , Glutamattransport German GLT-1 , voltage-clamp , CNS , Glutamatetransport English
Date of oral exam:	24 April 2007
Referee:	Name Academic Title Stoffel, Wilhelm Prof Dr. Dr. Dr. h.c.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2037