Universität zu Köln

Ninkovic, Tanja (2006). Immunology of a cancer mucin: Proteasomal processing and presentation of human MUC1 tandem repeat glycopeptides. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

MUC1 is a human transmembrane and secreted glycoprotein expressed in numerous epithelial tissues; in breast cancer tissues MUC1 is aberrantly glycosylated and a soluble form in the sera of cancer patients� triggers weak immune responses. The stimulation of cellular immune responses toward tumor-associated MUC1 glycoprotein is a primary goal in immunotherapeutic anti-cancer strategies. For an effective activation of tumor-MUC1 specific T-cell repertoires the extracellular MUC1 antigen should be presented by host dendritic cells in a MHC-dependent way. The generation of MHC class I epitopes is mainly performed by immunoproteasomes of dendritic cells. We performed in vitro studies to address the questions whether glycosylated MUC1 peptides are cleaved by IPs, and in which way the position and structure of O-linked glycans control the site specificity of peptide cleavage. In our work S|A|P (N-terminal) and G|S|T (C-terminal) were identified as the major processing sites within the non-glycosylated MUC1. These sequences are parts of the MUC1 tandem repeat sequence (HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA) which can be O-glycosylated on Thr and Ser residues. Glycosylation of the substrate in the close proximity of processing sites significantly reduced processing efficiency. Proteasomes were not able to digest glycopeptides carrying the Sialyl Gal-GalNAc glycan, often found in the tumor associated form on MUC1 glycoprotein. The best processed glycopeptide carried glycosylation on Thr of the central DTR motif, distant from major processing regions. The highest amount of glycosylated fragments with a potential to bind to the MHC class I groove was found in the digest of glycopeptides with glycosylation of Thr within the central DTR motif. Furthermore, the peptide SAPDTRPAPG glycosylated with GalNAc on Thr was identified in a cellular assay as an epitope with high affinity for the human HLA-A0201 allele. To confirm the processing pattern of MUC1 tandem repeat sequence obtained in vitro, cross-presentation of the MUC1 peptide on dendritic cells was performed, and eluted peptides from cell-derived exosomes corresponded to sequences found in vitro. These results indicate that design of a MUC1 glycopeptide based cancer vaccine should include glycopeptides with GalNAc on Thr of DTR motif, because of their efficient degradation by immunoproteasome, production of high amount of glycosylated 8- to 11-mers and potential generation of MHC class I binding SAPDTRPAPG-GalNAc epitope. For future work, immunisation of the MUC1 transgenic mice with DTR glycosylated peptides is in progress.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Immunologie eines Krebsmuzins: Proteasomale Prozessierung und Präsentation humaner MUC1 �tandem repeat�-Glykopeptide im MHC-Klasse I-Weg German
Translated abstract:	Abstract Language Zusammenfassung MUC1 ist ein humanes Transmembranprotein, das auf vielen epithelialen Geweben exprimiert wird. Die Glykosylierung von MUC1 auf Mammakarzinomzellen weicht von derjenigen auf Epithelzellen ab, und eine lösliche Form des Proteins im Serum der Patientin verursacht eine schwache Immunantwort des Körpers. Die Stimulierung einer zellulären Immunantwort gegen tumorassoziiertes MUC1 ist ein primäres Ziel immunotherapeutischer Strategien gegen Krebs. Zur effektiven Aktivierung eines für das tumorassoziierte MUC1 spezifischen T-Zell-Repertoires muß das Antigen von dendritischen Zellen in einer MHC-abhängigen Weise präsentiert werden; MHC-Klasse I-Epitope werden hierbei durch Immunoproteasome (IP) erzeugt. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro untersucht, ob MUC1-abgeleitete Peptide durch IPs abgebaut werden, und inwieweit dies von Position und Struktur von O-Glykanen beeinflusst wird. Die Sequenzen S|A|P (N-terminal) und G|S|T (C-terminal) wurden als die Hauptprozessierungsregionen innerhalb der MUC1-Aminosäuresequenz identifiziert. Diese Sequenzen sind Bestandteile der tandem repeat-Sequenz (HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA) innerhalb von MUC1, deren Serin- und Threoninreste potentielle Glykosylierungsziele sein können. Glykosylierung des Substrates in Nähe der Hauptprozessierungsregionen verminderte die Effizienz des Verdaus signifikant. Die Proteasomen konnten keine Glykopeptide verdauen, die das Glykan Sia Gal-GalNAc enthielten; solche Glykopeptide werden häufig in der tumorassoziierten Form von MUC1 gefunden. Glykopeptide, die am Threonin des zentralen DTR-Motivs � weit entfernt von den Hauptprozessierungsregionen � glykosyliert waren, wurden am besten verdaut. Zugleich resultierte aus solchen Glykopeptiden die höchste Menge an glykosylierten Prozessierungsprodukten, die aufgrund einer Länge von 8-11 Aminosäureresten am besten an die groove des MHC-Klasse I-Moleküls banden. Darüber hinaus ergab sich in einem zellulären Ansatz, daß das am Threonin mit GalNAc glykosylierte SAPDTRPAPG-Peptid eine hohe Affinität zum humanen HLA-A0201-Allel hatte. Um die in vitro gewonnenen Daten zur MUC1-Prozessierung zu bestätigen, wurde eine Kreuzpräsentation des MUC1-Peptides auf dendritischen Zellen durchgeführt. Die anschließend aus zellulären Exosomen eluierten Peptide entsprachen den Sequenzen, die in vitro gefunden worden waren. Aufgrund dieser Resultate sollten beim Design einer auf MUC1 basierten Krebsvakzine Glykopeptide verwendet werden, die am Threonin des DTR-Motivs mit einem GalNAc-Molekül glykosyliert wurden. Gründe hierfür sind der effiziente Verdau dieser Peptide durch Immunproteasome, die Produktion einer großen Menge glykosylierter Peptide mit einer Länge von 8 - 11 Aminosäureresten und die mögliche Generierung von SAPDTRPAPG-GalNAc-Epitopen, die an MHC-Klasse I-Moleküle binden. Im Hinblick auf zukünftige Arbeit erfolgt zur Zeit die Immunisierung transgener Mäuse mit Peptiden, die an der DTR-Sequenz glykosyliert sind. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Ninkovic, Tanja t.ninkovic@imperial.ac.uk UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-20739
Date:	2006
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut II für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Immunologie, Proteasom, Krebstherapie, Muzin, Glykoprotein German immunology, proteasome, cancer therapy, mucin, glycoprotein English
Date of oral exam:	25 October 2006
Referee:	Name Academic Title Hanisch, Franz-Georg Prof. Dr.rer.nat.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2073