Universität zu Köln

Pajonk, Simone (2007). SNARE-mediated plant immune responses at the cell periphery. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Pre-invasion resistance responses of Arabidopsis to the non-adapted barley powdery mildew fungus Blumeria graminis fsp hordei (B. g. hordei) require at least four PEN (penetration) genes. PEN1 to PEN4 encode a syntaxin, a ß-glycosyl hydrolase, an ABC transporter, and a γ-glutamylcysteine synthetase, respectively. Epistasis analysis suggests that the PEN1 syntaxin acts in a pathway that is different from a second pathway comprising PEN2, PEN3, and PEN4. Syntaxins are members of the SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) protein super family mediating intracellular vesicle trafficking processes in eukaryotic cells. In animals and yeast, syntaxins direct vesicle trafficking by forming ternary SNARE complexes with a SNAP25 adapter protein and a vesicle-resident v-SNARE (VAMP).The isolation of four independent pen1 alleles, each supporting enhanced cellular entry of B. g. hordei condidiospores, provided for the first time genetic evidence for the possible existence of a vesicle-based and secretory disease resistance mechanism at the cell periphery mediated by a single syntaxin family member. My work aimed to investigate PEN1 structure-function relationships using transgenic Arabidopsis plants that express engineered PEN1 variants at native levels in a pen1-1 null mutant background. Single amino acid substitutions that have previously been reported to affect the activity of syntaxins in Rattus norvegicus, Caenorhabditis elegans, and Drosophila melanogaster were introduced into the PEN1 sequence to generate a first set of PEN1 variants. Functional analysis of the respective Arabidopsis transgenic lines revealed that amino acid residues in and adjacent to the conserved SNARE domain are required for full PEN1 activity in disease resistance to B. g. hordei, thereby supporting the idea that PEN1 functions in this biological process like an authentic syntaxin that involve SNARE-SNARE domain interactions. Additional PEN1 variants involved N-terminal serine substitutions that were previously found to be phosphorylated in cultured Arabidopsis cells upon elicitation with the bacterial-derived flg22 peptide, which is recognized by the plasma membrane-resident FLS2 immune receptor. Phosphorylation of N-terminal residues upon flg22 elicitation has also been reported in the closely related family member, syntaxin SYP122. Transgenic lines expressing PEN1 phospho-mimic variants show wild-type-like PEN1 activity, but elevated B. g. hordei entry rates of lines expressing phospho-knockout derivatives suggest that N-terminal phosphorylation events modulate PEN1 activity during disease resistance responses. Unlike PEN1, a marked pathogen-inducible increase in protein levels of SYP122 was found only at late time points upon B. g. hordei challenge, raising the possibility that the apparent functional diversification of the closely related family members might be due to their differential accumulation patterns. However, constitutive overexpression of SYP122 could not complement the pen1 mutant phenotype although PEN1 overexpressing lines restored disease resistance to B. g. hordei. This suggests that in disease resistance to B. g. hordei the functional diversification between PEN1 and SYP122 is complete. Functional GFP-tagged PEN1 has previously been shown to accumulate beneath attempted powdery mildew entry sites. I found that the candidate interacting SNARE proteins SNAP33 and VAMP722 co-localized with PEN1 at such sites. Interestingly, non-functional PEN1 variants also accumulate at fungal entry sites, indicating that the focal accumulation is not a marker of PEN1 activity. I discuss a model in which PEN1 accumulation at fungal entry sites and PEN1 activity in disease resistance are separate biological processes.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language SNARE-Protein vermittelte pflanzliche Immunreaktionen an der Zellperipherie German
Translated abstract:	Abstract Language An prä-invasiven Abwehrmechanismen von Arabidopsis gegen den Gerstemehltau Blumeria graminis fsp hordei sind mindestens vier PEN-Gene ("Penetrationsgene") beteiligt. Diese Gene (PEN1 bis PEN4) kodieren für ein Syntaxin, eine ß-Glycosyl-hydrolase, einen ABC-Transporter und eine γ-Glutamylcysteinsynthetase. Durch Analyse der genetischen Interaktionen der PEN-Gene konnte eine Funktion für das PEN1 Syntaxin in einem von PEN2, PEN3 und PEN4 unabhängigen zellulären Mechanismus gezeigt werden. Syntaxine gehören zur Protein-Superfamilie der SNAREs (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor), die an intrazellulären Vesikeltransportprozessen in eukaryotischen Zellen beteiligt sind. Es konnten vier unabhängige Allele von pen1 isoliert werden, die alle eine erhöhte Eintrittsrate des Gerstenmehltaus B. g. hordei aufwiesen. Diese Syntaxin Defektallele lieferten zum ersten Mal genetische Hinweise auf einen möglichen Vesikel-basierten sekretorischen Resistenzmechanismus an der Peripherie der Zelle, der durch ein einzelnes Mitglied der Syntaxin-Familie getragen wird. Aus Tieren und Hefen ist bekannt, dass Syntaxine durch Komplexbildung mit SNAP25 Adaptorproteinen und Vesikel-assozierten VAMP Proteinen (vesicle associated membrane protein) an der Vermittlung von Vesikelfusionprozessen an Zielmembranen beteiligt sind. Ziel dieser Arbeit war es, eine Struktur-Funktionsanalyse von PEN1 in transgenen Arabidopsis-Pflanzen durchzuführen, die verschiedenen Varianten von PEN1 in nativen Mengen in einem Nullmutanten-Hintergrund exprimieren. Durch Funktionsanalyse von transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die PEN1-Varianten mit einzelnen Aminosäure-austauschen exprimieren, für die bekannt ist, dass sie die Aktivität von Syntaxinen in Rattus norvegicus, Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Aminosäuren innerhalb und nahe der konservierten SNARE-Domäne für volle Aktivität von PEN1 in der Resistenzreaktion gegen B. g. hordei nötig sind. Dieser Befund unterstützt die Hypothese, dass PEN1 in diesem biologischen Prozess als authentisches Syntaxin über SNARE-Domänen-Interaktionen fungiert. Weitere generierte und analysierte PEN1-Varianten, beinhalteten Serin-Substitutionen am Aminoterminus von PEN1. Für die hier ausgetauschten Serinreste ist in Arabidopsis-Zellkulturen eine Phosphorylierung nach Induktion mit dem bakteriellen flg22-Peptid, das durch den Plasmamembranrezeptor FSL2 erkannt wird, gezeigt worden. Eine ähnliche flg22-induzierte Phosphorylierung an aminoterminalen Serinresten ist auch für das sequenzverwandte SYP122 Syntaxin von Arabidopsis gezeigt worden. Interessanterweise zeigten transgene Pflanzenlinien, die Phosphorylierungsimitationsvarianten von PEN1 exprimierten, Wildtyp-ähnliche Pilzeintrittsraten. Hingegen zeigten transgene Pflanzenlinien mit unphophorylierbaren PEN1-Varianten erhöhte Eintrittsraten des Gerstemehltaus. Dieser Befund weist darauf hin, dass N-terminale Phosphorylierungereignisse die Aktivität von PEN1 in Abwehrreaktionen modulieren. Im Vergleich zu PEN1 zeigt SYP122 einen deutlichen pathogen-induzierten Anstieg in der Proteinmenge zu späten Zeitpunkten nach Inokulation mit Gerstenmehltau. Die scheinbare funktionelle Diversifizierung könnte dementsprechend zwischen beiden verwandten Proteinen auf ihren unterschiedlichen Proteinmengen beruhen. Allerdings konnte eine Überexpression von SYP122 im pen1 Nullmutanten-Hintergrund die erhöhte pilzliche Eintrittsrate des pen1 Phänotypen nicht komplementieren, wohingegen eine Überexpression von PEN1 die Resistenz gegen B. g. hordei Eintritt wiederherstellen konnte. Das weist daraufhin, dass die funktionelle Diversifizierung zwischen PEN1 und SYP122 in der Eintrittsresistenz gegen Gerstenmehltau vollständig ist. Es ist bekannt, dass funktionales GFP-markiertes PEN1 unter versuchten Eintrittsstellen des Gerstenmehltaus akkumuliert. Hier konnte gezeigt werden, dass die potenziellen SNARE-Interaktionspartner von PEN1, SNAP33 und VAMP722, mit PEN1 an solchen Stellen ko-lokalisieren. Interessanterweise akkumulieren auch nicht-funktionale PEN1 Varianten an dieser Stelle, was zeigt, dass die fokale Akkumulierung kein Marker für PEN1 Aktivität ist. Ich schlage ein Modell vor, in dem PEN1 Akkumulierung und PEN1 Aktivität zwei unterschiedliche Prozesse darstellen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Pajonk, Simone pajonk@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-21664
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Nichtwirtsresistenz , Penetrationsresistenz , pflanzliche Immunantwort , Mehltau , Exosomale Sekretion German non-host resistance , plant immune responses , powdery mildew , penetration resistance , vesicle traffic , exosomal secretion English
Date of oral exam:	24 June 2007
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2166