Universität zu Köln

Miletic, Hrvoje (2008). Gene therapy of malignant glioma with retroviral vectors and tumor-infiltrating progenitor cells. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Gene therapy as a therapeutic strategy in the treatment of human gliomas is limited by the efficacy of gene transfer and intratumoral distribution of viral vectors. The major goals of this study were to enhance the gene transfer to glioma cells in vivo by using lentiviral vectors and to improve intratumoral distribution by selecting migratory progenitor cells that could function as packaging cells for the viral vectors. Therefore, the final goal was to establish tumor infiltrating packaging cells that release viral vectors within glioma in vivo. Lentiviral vectors were chosen to deliver genes into glioma cells. In contrast to currently used retroviral vectors, they transduce quiescent as well as mitotic cells. This is of major importance as within a defined treatment window, the majority of tumor cells are not mitotically active. However, lentiviral vectors can also infect normal brain cells. To define vectors with a specific tropism for glioma cells, lentiviral vectors pseudotyped with two different glycoproteins were used. Vectors pseudotyped with glycoproteins of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV-GP) mediated efficient and specific transduction of rat glioma cells in vitro and in vivo, whereas vectors pseudotyped with the glycoproteins of the vesicular stomatatitis virus (VSV-G) preferentially transduced normal brain cells [Miletic et al., 2004]. Bone marrow derived progenitor cells were isolated to establish the tumor-infiltrating cells (BM-TICs) that could also serve as packaging cells. BM-TICs have a high passaging capacity in vitro, which is necessary for genetic modification and large scale production in the clinic. They were also found to show specific migration towards and into malignant glioma in vivo. In a therapeutic approach using BM-TICs stably expressing a suicide gene, an efficient therapeutic effect was demonstrated. The modified cells were also detected in vivo by non-invasive positron emission tomography (PET) and therapeutic outcome was followed-up by imaging methods and correlated with histopathology [Miletic et al., 2007]. To test packaging capabilities of BMTICs, the cells were modified with packaging constructs for retroviral LCMV-GP pseudotypes (BM-TIPCs). BM-TIPCs continuously produced retroviral vector particles for several weeks. Upon injection into experimental rat glioma, these cells migrated and were widely distributed within the tumor. Furthermore, released vector particles transduced glioma cells in solid as well as border areas [Fischer, Miletic et al., 2007]. In conclusion, the presented packaging system is highly attractive for future therapeutic applications in human glioblastoma especially in conjunction with an imaging-guided approach.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Gentherapie maligner Gliome mit retroviralen Vetoren und tumor-infiltrierenden Vorläuferzellen German
Translated abstract:	Abstract Language Die Wirksamkeit der Gentherapie maligner Gliome war in bisherigen klinischen Studien durch einen ineffizienten Gentransfer und eine geringen Ausbreitung von viralen Vektoren innerhalb des Tumorgewebes limitiert. Die Zielsetzung dieser Arbeit war sowohl die Tranduktionseffizienz maligner Gliomzellen durch Verwendung von lentiviralen Vektoren zu erhöhen als auch die Vektorverteilung innerhalb des Tumorgewebes durch Einsatz von migratorischen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark zu optimieren. Diese Zellen sollten dabei als Verpackungszellen für die viralen Vektoren dienen. In der vorliegenden Arbeit wurden lentivirale Vektoren für die Transduktion maligner Gliome untersucht, weil diese im Gegensatz zu den bisher häufig verwendeten retroviralen Vektoren neben teilungsaktiven auch ruhende Zellen infizieren. Dies ist von herausragender Bedeutung, da sich die meisten Tumorzellen innerhalb eines definierten therapeutischen Fensters nicht in Mitose befinden. Ein Nachteil lentiviraler Vektoren ist jedoch, dass sie auch normale Hirnzellen infizieren. Um Vektoren mit einem spezifischen Tropismus für Gliomzellen zu identifizieren, wurden zwei verschiedene pseudotypisierte lentivirale Vektoren verwendet. Dabei zeigten Vektoren, pseudotypisiert mit dem Glykoprotein des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV-GP), in vivo und in vitro einen hohen Tropismus für maligne Gliomzellen, während Vektoren, pseudotypisiert mit dem Glykoprotein des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV-G), bevorzugt normale Hirnzellen transduzierten [Miletic et al., 2004]. Ein weiteres Ziel war nun tumorinfiltrierende Zellen zu generieren, welche als Verpackungszellen für die LCMV-GP Pseudotypen dienen können und das Potential haben, durch intratumorale Migration die Vektorverteilung zu erhöhen. Dazu wurden multipotente adulte Vorläuferzellen (BM-TICs) nach einem etablierten Protokoll aus dem Knochenmark isoliert. BM-TICs sind in vitro stark expandierbar, was die Grundlage für die Etablierung einer stabilen Verpackungslinie ist. Darüber hinaus zeigten die Zellen eine ausgeprägte Migrationsfähigkeit innerhalb von experimentellen Rattengliomen in vivo. In einem therapeutischen Ansatz konnten wir demonstrieren, dass BM-TICs, stabil transduziert mit einem Suizidgen, einen effizienten therapeutischen Effekt aufwiesen. Weiterhin konnten die modifizierten Zellen mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) detektiert werden. Auch der therapeutische Effekt konnte mittels nicht-invasiver Bildgebung verfolgt werden und korrelierte mit der histopathologischen Auswertung [Miletic et al., 2007]. Als �proof of principle� wurde eine stabile Verpackungslinie für retrovirale LCMV-GP Pseudotypen auf Basis von BM-TICs etabliert (BM-TIPCs). Nach genetischer Modifikation mit den Verpackungskonstrukten produzierten die Zellen kontinuierlich, über einen Zeitraum von mehreren Wochen, retrovirale Vektorpartikel. Bei Injektion in experimentelle Rattengliome, zeigten BM-TIPCs keinen Verlust der Migrationsfähigkeit. Von den Zellen freigesetzte Vektorpartikel transduzierten benachbarte Gliomzellen in soliden Tumorarealen als auch im Randbereich [Fischer, Miletic et al., 2007]. Somit hat das hier vorgestellte System ein hohes Potential für die therapeutische Applikation bei humanen Glioblastomen insbesondere in Verbindung mit nicht-invasiver Bildgebung als Kontrolle der therapeutischen Effizienz. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Miletic, Hrvoje hrvoje_miletic@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-22469
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Pathologie und Neuropathologie > Institut für Neuropathologie
Subjects:	Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Gentherapie, maligne Gliome, retrovirale Vektoren, Stammzellen, Positronenemissionstomographie German gene therapy, malignant glioma, retroviral vectors, stem cells, positron emission tomography English
Date of oral exam:	7 October 2007
Referee:	Name Academic Title Jacobs, Andreas Prof. Dr. med.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2246