Universität zu Köln

Horváth, Mihály (2007). Arabidopsis AMP-activated protein kinases in proteasomal complexes and their role in cell signaling. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF MihalyHorvathPhD.pdf Download (3MB)

Abstract

AMP-activated protein kinases (AMPK) are structurally and functionally highly conserved in all eukaryotes. The most profoundly studied yeast AMPK ortholog, Snf1, plays a role in the sensing and response to low energy and nutrient levels. There is much less information available about the function of plant Snf1 orthologs, termed Snf1-related protein kinases (SnRKs) and their regulatory roles in plant specific nutrient regulated mechanism, such as photosynthesis, plant hormone signaling and metabolism. Genetic studies of plant SnRK1 kinases are impeded by the lack of T-DNA insertion mutants in the SnRK1 catalytic subunits and the lack of male transmission of mutations affecting the SnRKγ subunit. The present work describes the isolation of T-DNA insertion mutations in SnRK1 β subunit genes and characterization of these mutants. Single and double mutant plants did not show any observable developmental or sugar signaling phenotype. Triple SnRK1β mutant could not be generated because no mutant allele is available for the third beta subunit. In our experiments overexpression of GFP-tagged SnRK1 beta subunits did not show subcellular relocalization in response to nutritional stress, a mechanism which was described in yeast. Instead, rapid proteasomal degradation of Arabidopsis SnRK1 subunits was observed in response to sugars and light. Proteasomal degradation of SnRK1 subunits prevented their efficient overexpression for biochemical studies. Former in vitro and in vivo studies found SnRK1 kinases in proteasomal complexes in Arabidopsis. This observation correlates with the fact that numerous nutrient status regulated metabolic enzymes are proteasomal substrates in Arabidopsis as in yeast and their degradation is controlled by phosphorylation and sugar availability. In order to identify SnRK1 interacting partners in vivo, it was attempted to isolate protein complexes from Arabidopsis through tagged SnRK1 subunits. In contrast to a former and mostly unsuccessful immunoaffinity purification approach, this work applies a rapid tandem affinity chromatography-based protein purification method. In addition to developing a biochemical approach for identification of SnRK1 interacting partners, we further explored the proteasomal connection of SnRK1 kinases and searched for their potential substrates using in vitro phosphorylation studies. Several sugar-regulated proteasomal substrates and F-box proteins were overexpressed in E. coli and purified to near homogeneity along with similar purification of SnRK1 kinase catalytic subunits. The purified proteins were subjected to in vitro kinase reactions using radioactive γ32P-ATP and phosphorylation was detected in more cases. Some of the phosphorylation sites were successfully identified by mass spectrometric analysis. Site-directed mutagenesis of the phosphorylation site on IAA6 and overexpression of the mutant construct indicates the importance of phosphorylation site in vivo. In order to provide further evidence for interaction of SnRK1 kinases with their substrates in vivo, an assay system for testing the stability of kinase substrates was developed.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Arabidopsis AMP-aktivierte protein Kinase in proteasomale Komplexen und deren Rolle in Signal Transduktion German
Translated abstract:	Abstract Language AMP-aktivierte Proteinkinasen (AMPK) sind in allen Eukaryoten strukturell und funktionell in hohem Maße konserviert. Am besten ist die Hefe Protein Kinase Snf1 erforscht. Sie spielt eine große Rolle beim Erkennen und Reagieren auf niedriges Energieangebot und Nährstoffmangel. Es gibt weit weniger Information über die Funktionen der Snf1-Orthologe in Pflanzen. So sind zum Beispiel deren regulatorische Rolle in pflanzenspezifischen, ernährungsabhängig regulierten Mechanismen wie Photosynthese und Pflanzenhormon-Signal Transduktion unbekannt. Genetische Studien an Pflanzen-SnRK1 Kinasen werden durch den Mangel an T-DNA Insertionsmutanten in katalytische Untereinheiten der SNRK1 und durch Mutationen in der SnRKγ-Untereinheit, die männliche Sterilität verursacht, erschwert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Isolation von T-DNA Insertions-Mutanten in SnRK1-ß -Untereinheiten und deren Charakterisierung. Einfach und zweifach mutierte Pflanzen zeigten keine sichtbaren Entwicklungs- oder Zucker anzeigenden Phänotypen. Dreifach mutierte Pflanzen konnten nicht aufgezogen werden, da für die dritte Beta �Untereinheit kein Mutantenallel erhältlich ist. Überexpression der GFP-markierten SnRK1 Beta-Untereinheiten zeigte keine subzelluläre Relokalisation als Antwort auf ernährungsbedingten Stress, ein Mechanismus, der in Hefe beschrieben wurde. Stattdessen wurde als Antwort auf Zucker und Licht ein rascher proteosomaler Abbau der Arabidopsis SnRK1 Untereinheiten beobachtet. Der proteosomale Abbau von SnRK1-Untereinheiten verhinderte ihre effiziente Überexpression für biochemische Studien. Frühere in vivo und in vitro Studien entdeckten Arabidopsis SNRK1 Kinasen in proteosomalen Komplexen. Diese Beobachtung wird dadurch unterstützt, dass zahlreiche durch die Ernährung regulierte metabolische Enzyme in Arabidopsis wie auch in Hefe proteosomale Substrate sind, und ihr Abbau durch Phosphorylierung und die Verfügbarkeit von Zucker kontrolliert wird. Um SnRKl interagierende Partner in vivo zu identifizieren, wurde versucht, Proteinkomplexe aus Arabidopsis durch markierte SnRK1-Untereinheiten zu isolieren. Im Gegensatz zu frühereren, meist erfolglosen Versuchen durch Immunoaffinitätsreinigung, verwendet diese Arbeit eine rasche auf Tandem-Affinitäts-Chromatographie basierende Proteinreinigungsmethode. Außer der Entwicklung eines biochemischen Versuchs zur Identifizierung SnRK1 interagierenden Partner, erforschten wir auch die proteosomale Verbindung der SnRK1 Kinasen und suchten durch die Anwendung von in vitro Phosphorylierungsexperimenten nach deren potentiellen Substraten. Einige Zucker-regulierte proteosomale Substrate, F-box - Proteine und auch SnRK1-Kinase Untereinheiten wurden in E.coli überexprimiert und mittels einer chromatographische Reinigung nahezu homogen gereinigt. Die gereinigten Proteine wurden durch Einsatz von radioaktivem γ32-ATP in in vitro Kinase-Reaktionen unterworfen, wobei mehrere Phosphorylierungen detektiert wurden. Einige der Phosphorylierungsstellen wurden durch Massenspektrometrie erfolgreich identifiziert. Zielgerichtete Mutagenesis der IAA6 Phosphorylierungsstelle und Überexpression des Mutantenkonstruktes bestätigte die Bedeutung dieser Phosphorylierungsstelle in vivo. Um weitere Belege für die Interaktion der SnRK1 Kinasen und ihre Substrate in vivo zu liefern, wurde ein Versuchs-System zum Test der Stabilität der Kinase-Substrate entwickelt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Horváth, Mihály mihaly@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-22669
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Proteasome , Degradation , Zucker, AMPK German proteasome , degradation , sugar , AMPK English
Date of oral exam:	16 January 2008
Referee:	Name Academic Title Flügge, Ulf Ingo Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2266