Charakterisierung HAIRY MERISTEM-ähnlicher Gene und Identifizierung neuer Regulatoren der Seitentriebentwicklung in Arabidopsis thaliana

Schulze, Silke (2007). Charakterisierung HAIRY MERISTEM-ähnlicher Gene und Identifizierung neuer Regulatoren der Seitentriebentwicklung in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifikation und Charakterisierung von Regulatoren der Seitentriebentwicklung von A. thaliana. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das mutierte Gen der Mutante eol5, in der der las-4-Phänotyp verstärkt wurde, kartiert. Die Analysen mit SSLP- und CAPS-Markern zeigten, dass eol5 auf Chromosom 2 lokalisiert ist und dass auf Chromosom 5 des Ler-Ökotyps ein QTL lokalisiert ist, der den Verzweigungsdefekt der las-4-Mutante verstärkt. Der Einfluss dieses QTL und der Anteil von Ler-Allelen auf den las-4-Phänotyp wurde durch Rückkreuzungen vermindert. Die F2-Generationen dieser Rückkreuzungen werden als Grundlage zur Feinkartierung von eol5 auf Chromosom 2 genutzt. Entsprechende molekulare Marker wurden etabliert. Die Grundlage für den zweiten Teil dieser Arbeit lieferte der Verzweigungsdefekt von 35S::miR171 Pflanzen. Die Fehlexpression der miR171a in A. thaliana führte bei Pflanzen unter Langtagbedingungen zu einer stark verminderten Bildung von Seitentrieben während der vegetativen und reproduktiven Phasen der Entwicklung. Bei der Kultivierung in kurzen Photoperioden terminerten die Pflanzen ihr Wachstum während der vegetativen Phase. In silico Analysen zeigten, dass die drei GRAS-Gene SCL6, SCL22 und SCL27 die Zielgene von miR171 sind. Es wurden Verlustmutanten der drei Gene isoliert und der Ausfall der SCL6-, SCL22- oder SCL27-Genaktivitäten auf das Verzweigungsmuster von A. thaliana untersucht. Die Einzelmutante scl27-1 zeigte eine veränderte Seitentriebbildung unter Kurztag-bedingungen, die in der vegetativen und reproduktiven Phase der Entwicklung auftrat. Die Erzeugung aller möglichen Doppelmutanten und einer Tripelmutante für die mutierten Allele scl6-1, scl22-1 und scl27-1 diente dazu, durch funktionelle Redundanz verdeckte Funktionen der Proteine zu identifizieren. Es wurde gefunden, dass auch SCL6 und SCL22 die Seitentriebentwicklung beeinflussen. Die scl22-1 scl27-1-Doppelmutante zeigte eine Phänokopie der 35S::miR171-Linie. Weitere Experimente zum Einfluss der Photoperiode auf den Terminationsphänotyp der scl22-1 scl27-1 und der scl6-1 scl22-1 scl27-1-Mutante zeigten, dass die Dauer der Kultivierung unter Kurztagbedingungen einen entscheidenden Einfluss auf die Termination des Apikalmeristems hat. scl22-1 scl27-1 und scl6-1 scl22-1 scl27-1-Mutanten, die nach mehr als 35 Tagen Wachstum unter Kurztagbedingungen durch lange Photoperioden induziert wurden, hatten die Kompetenz verloren, die Termination des Apikalmeristems zu verhindern. Dieser Einfluss zeigte sich auch in 35S::miR171 co-Pflanzen. Ohne CO-Genaktivität bildete sich auch unter Langtagbedingungen ein Terminationsphänotyp aus. Die Funktionen der drei SCL Gene wurden auch in RNA-ISH-Experimenten untersucht. Es zeigte sich, dass SCL22 und SCL27 ein sehr ähnliches Expressionsmuster aufwiesen. Transkripte beider Gene fanden sich im vegetativen und reproduktiven Apikalmeristem, in Lateralmeristemen und in den Leitbündeln von Spross und Blatt. SCL6 Transkripte wurden in der interprimordialen Region im vegetativen und reproduktiven Apikalmeristem nachgewiesen. Die Funktion von SCL22 und SCL27 bei der Seitentriebentwicklung wird nach der Initiation der Lateralmeristeme benötigt. Neben den phänotypischen Daten der Mutanten scl27-1, scl6-1 scl27-1, scl22-1 scl27-1 und scl6-1 scl22-1 scl27-1 be-stätigten dies auch RNA-ISH-Experimente mit den Meristemmarkern STM und LAS. In Apices der Mutanten scl22-1 scl27-1 und scl6-1 scl22-1 scl27-1 konnte eine meristematische Identität der Achselzellen nachgewiesen werden. Die Aktivitäten von SCL22 und SCL27 sind vermutlich bei der Entwicklung von Lateralmeristemen zu Seitentriebknospen notwendig. Durch die Charakterisierung der Doppelmutanten von las-4 und scl6-1, scl22-1 oder scl27-1 sollte eine mögliche Funktion der Proteine in einem regulatorischen Signalweg aufgedeckt werden. Die Analyse der las-4 scl27-1-Mutante zeigte, dass sich die Phänotypen der Einzelmutanten addierten und dass das scl27-1 Allel den las-4-Phänotyp verstärkte. Die histologischen Analysen von scl22-1 scl27-1, scl6-1 scl22-1 scl27-1 und Wildtyp-Pflanzen ergaben, dass sich im Meristem der Mutanten zusätzliche Zellschichten bildeten. Diese Zunahme korrelierte mit der Dauer der Kultivierung der Pflanzen im Kurztag. Eine weitere auffällige Veränderung in den Mutanten war das Auftreten von ektopischen Meristemen, die isoliert im Sprossgewebe lagen. Ihr meristematischer Charakter konnte in RNA-ISH-Experimenten mit den Meristemmarkern STM und WUS nachgewiesen werden. Auch in den Strukturen, die sich als Vorwölbungen in den Blattachseln von scl22-1 scl27-1 und scl6-1 scl22-1 scl27-1-Mutanten bildeten und Meristemdome genannt wurden, fanden sich ähnliche ektopische Meristeme. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen vermuten, dass die drei SCL-Proteine eine wichtige Rolle bei der Zellteilung und der Organbildung im Apikal- und Lateralmeristem spielen.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Characterisation of HAM-like genes and Identification of novel regulators of side shoot development in Arabidopsis thaliana	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Aim of this thesis was the identification and characterisation of novel regulators of side shoot formation in A. thaliana. The focus of the first part was mapping of the mutated gene of the eol5 mutant. This mutant is characterised by an enhancement of the las-4 phenotype. Analysis with SSLP und CAPS markers revealed a localisation of eol5 on chromosome 2 and a QTL from the ecotype Ler on chromosome 5, which enhances the las-4 phenotype. Backcrosses were performed to diminish the influence of the QTL and Ler alleles on the las-4 phenotype. The F2 generations of these backcrosses will be used for fine mapping of eol5 on chromosome 2. New molecular markers for this approach have been established. The branching defect of 35S::miR171 plants was the starting point of the second part of the thesis. Under long day conditions, misexpression of miR171a in A. thaliana resulted in an enhanced reduction of side shoot formation during the vegetative and reproductive phase of development. The plants terminated growth in short photoperiods during the vegetative phase. In silico analysis revealed that three GRAS genes, SCL6, SCL22 and SCL27, are target genes of miR171. To evaluate the influence of SCL6, SCL22 and SCL27 on the branching pattern in A. thaliana loss of function mutants for all three genes were isolated and phenotypically characterised. In short photoperiods, the mutant scl27-1 showed altered formation of side shoots during the vegetative and reproductive phase of development. All possible double mutants and a triple mutant were generated to uncover possible functional redundancies among the three proteins. Analysis of these mutants revealed that SCL6 and SCL22 also have an impact on side shoot formation. The double mutant scl22-1 scl27-1 phenocopies the 35S::miR171 line. Further investigations indicated an influence of the photoperiod on the termination phenotype in scl22-1 scl27-1 and scl6-1 scl22-1 scl27-1 mutant plants and that extended cultivation in short photoperiods is essential for termination of the apical meristem. scl22-1 scl27-1 and scl6-1 scl22-1 scl27-1 plants, grown for more than 35 days under short day conditions and thereafter induced by long photoperiods, lost their ability to prevent termination of the apical meristem. This photoperiodic influence on the termination phenotype was also observed in 35S::miR171 co plants. Without CO activity, the plants developed a termination phenotype under long day conditions. A function of the three SCL genes was also analysed by RNA-ISH experiments. The expression pattern of SCL22 and SCL27 were similar and transcripts of both genes were detected in apical meristems of vegetative and reproductive stage, lateral meristems and the vasculature of shoots and leaves. SCL6 transcripts were detected in interprimordial regions of vegetative and reproductive apical meristems. The activity of SCL22 and SCL27 is needed for the development of side shoots after the initiation of lateral meristems. This was indicated by the phenotypic data of scl27-1, scl6-1 scl27-1, scl22-1 scl27-1 and scl6-1 scl22-1 scl27-1 mutant plants and could be confirmed in RNA-ISH experiments with the meristem markers STM und LAS. A meristematic identity of cells in the interprimordial region of apices of scl22-1 scl27-1 and scl6-1 scl22-1 scl27-1 mutant plant was detected. A possible function of the three proteins and LAS in one regulatory pathway was investigated by the characterisation of double mutants between las-4 and scl6-1, scl22-1 or scl27-1. Analysis of las-4 scl27-1 mutant plants revealed an additive phenotype. Furthermore, the scl27-1 allele enhanced the las-4 phenotype. Histological analysis of scl22-1 scl27-1, scl6-1 scl22-1 scl27-1 and wildtype plants was performed to detect morphological differences. It was shown that mutant plants developed extra layers of cells within the meristem. This increase in cell layers correlated with the cultivation period under short day conditions. The occurrence of insulated ectopic meristems within the shoot tissue was another morphological difference between mutant and wildtype plants. The meristematic character of these ectopic meristems was proven in RNA-ISH experiments with STM und WUS as meristem markers. Similar ectopic meristems were found in structures called 'Meristemdom', which developed as protrusions within the leaf axils of scl22-1 scl27-1 and scl6-1 scl22-1 scl27-1 mutant plants. The results of this thesis suggest an important role for the three SCL proteins in the process of cell division and organ formation in shoot- and lateral meristem.

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