Universität zu Köln

Schwab, Melanie (2008). Identification of novel seed dormancy mutants in Arabidopsis thaliana and molecular and biochemical characterization of the seed dormancy gene DOG1. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Seed dormancy is defined as the failure of a viable seed to germinate under favorable conditions. In addition to having an adaptive role in nature by optimizing germination to the best suitable time, dormancy control is also important in crop plants. Seed dormancy is induced during seed maturation and can be released by after-ripening or stratification. The molecular mechanisms of the induction and the release of dormancy are largely unknown. In this project novel seed dormancy mutants involved in the release of dormancy by stratification or after-ripening were identified in mutagenesis screens. Several mutants that fail to germinate under such conditions and additional novel non-dormant mutants have been isolated, which provide promising genetic material for follow up studies. In addition, an in-depth molecular and biochemical characterization of a key dormancy gene, DELAY OF GERMINATION 1 (DOG1), was carried out. DOG1 is an alternatively spliced gene and encodes a protein of unknown function. Mutant alleles of DOG1 are completely non-dormant, indicating that DOG1 is absolutely required for seed dormancy induction. Promoter activity studies demonstrated that the DOG1 promoter drives seed-specific expression in the endosperm and the embryo. The cell-specific expression pattern was studied by additional in-situ hybridization experiments, which showed that DOG1 transcripts are localized in the vascular system and highly accumulated in the shoot apical meristem of the embryo. At the subcellular level, the DOG1 protein variants are mainly localized in the nucleus. Quantitative RT-PCR demonstrated that DOG1 is maximally expressed during seed maturation, 14-17 days after flowering, and that the relative abundance of each splicing variant changes during the final stages of seed maturation. In addition, it was shown that DOG1 expression and protein levels correlate with the degree of dormancy and that low temperatures during seed development cause an increase in DOG1 transcript levels and seed dormancy. The functionality of the different splicing variants was studied by transgenic complementation and overexpression approaches using the single splicing forms and a genomic sequence of the gene. Single splicing forms only induced dormancy when highly overexpressed, above a specific threshold. Below that threshold, a combination and probably also a specific ratio of the different splicing forms were required for dormancy function. DOG1 protein was only detected in the dormant overexpression lines, in which protein production probably outcompeted its degradation. These results strongly indicate that the function of DOG1 is determined by the presence and the ratio of all splicing forms, which is required to sustain protein stability.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Identifizierung neuer Dormanz-Mutanten und molekulare und biochemische Charakterisierung des Dormanzgens DOG1 German
Translated abstract:	Abstract Language Samenruhe, auch Dormanz genannt, wird definiert als Ausbleiben der Samenkeimung eines wachstumsfähigen Samens bei optimalen Bedingungen. Dieser Anpassungsmechanismus an die Umwelt verhindert das vorzeitige Auskeimen des Samens zu einem ungünstigen Zeitpunkt. Die Steuerung von Dormanz ist auch bei Kulturpflanzen von Bedeutung. Dormanz wird während der Samenentwicklung induziert und kann durch Mechanismen wie Nachreife oder Stratifizierung aufgehoben werden. Die molekularen Mechanismen dieser Prozesse sind allerdings weitgehend unbekannt. Um neue Regulatoren von Dormanz sowie Dormanz-brechenden Mechanismen zu identifizieren, wurden Mutagenese-Screens durchgeführt. Dabei wurden mehrere Mutanten isoliert, deren Dormanz nicht durch Nachreife oder Stratifizierung gebrochen werden kann. Zusätzlich wurden nicht-dormante Mutanten isoliert, die nicht allelisch zu bekannten Dormanz Genen waren. Weiteres Ziel der Arbeit war es, das bisher unbekannte Schlüsselgen für Samenruhe, DELAY OF GERMINATION 1 (DOG1), molekular und biochemisch zu charakterisieren. Dieses Gen wird alternativ gespleißt und kodiert ein Protein mit unbekannter Funktion. DOG1-Nullmutanten weisen keinerlei Dormanz auf, was auf eine essentielle Rolle von DOG1 in der Dormanz Regulation hinweist. Promotor-Reportergen Konstrukte zeigten, dass der DOG1 Promotor samenspezifische Expression im Embryo und im Endosperm steuert. Zusätzliche in-situ Hybridisierungsexperimente verdeutlichten, dass DOG1 mRNA im vaskulären System lokalisiert ist und im apikalen Sprossmeristem des Embryos akkumuliert. Auf subzellulärer Ebene konnte gezeigt werden, dass alle DOG1 Isoformen hauptsächlich nukleare Lokalisierung aufweisen. Quantitative RT-PCR demonstrierte, dass das Expressionsmaximum von DOG1 14-17 Tage nach Blühbeginn während der Samenreife erreicht wurde. Am Ende dieser Phase trat eine Veränderung der relativen Menge der verschiedenen Transkripte ein. Das Expressionsniveau und die Menge an akkumuliertem DOG1 Protein korrelierten mit dem Dormanzgrad. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass niedrige Temperaturen während der Samenentwicklung zu einer Erhöhung des DOG1 Expressionsniveaus und zu stärkerer Dormanz führen. Die Funktionalität der verschiedenen Spleiß-Varianten wurde mit Komplementations- und Über-expressionskonstrukten der einzelnen Spleiß-Varianten und eines genomischen DOG1 Fragments untersucht. Eine einzelne Variante konnte in transgenen Pflanzen nur dann Dormanz induzieren, wenn diese stark überexprimiert war und einen bestimmten Grenzwert überschritt. Unterhalb dieser Schwelle ist eine Kombination und möglicherweise auch ein bestimmtes Verhältnis der Formen für die Dormanz Funktion notwendig. DOG1 Protein war nur in dormanten Überexpressionslinien nachweisbar, in denen vermutlich Degradationsprozesse den Überschuss an Protein weniger schwer beeinträchtigten. Dies deutet darauf hin, dass die verschiedenen DOG1 Varianten für die Bildung eines stabilen und funktionellen DOG1 Protein Komplexes notwendig sind. Alternatives Spleißen stellt dabei einen feinregulatorischen Mechanismus dar, der für die Funktion und Protein Stabilität von DOG1 eine wichtige Rolle spielt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schwab, Melanie melanie@melanieschwab.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-23930
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Arabidopsis thaliana, Samenruhe, Alternatives Spleißen, Protein Stabilität, DOG1 German Arabidopsis thaliana, seed dormancy, alternative splicing, protein stability, DOG1 English
Date of oral exam:	19 May 2008
Referee:	Name Academic Title Koornneef, Maarten Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2393