Universität zu Köln

Meyer, Dorit (2008). Molecular characterization of pathogen-triggered cell polarity. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Cell polarity is a common response of single plant cells in response to bacterial or fungal attack, typically leading to a polar rearrangement of the cytoskeleton and directional movement of various organelles such as the nucleus and Golgi to pathogen contact sites at the cell surface. This process is accompanied by a re-localisation of a subset of proteins and directed vesicle trafficking that might contribute to focal deposition of de novo synthesized cell wall material (called papilla) between the preformed plant cell wall and the plasma membrane underneath pathogen contact sites. Secretory processes involving vesicles that release antimicrobial cargo and cell wall building blocks have been thought for a long time to contribute to plant defence. Recently, genetic evidence proved �soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor� (SNARE) proteins, which are known to drive intracellular vesicle fusions in various eukaryotes, to be required for resistance responses. A ternary SNARE complex containing plasma membrane-resident PEN1 syntaxin, SNAP33 and endomembrane resident VAMP721/722 is essential to restrict entry of several tested powdery mildew fungi into leaf epidermal sites. Focal accumulation of each of these three proteins at incipient fungal entry sites implies the existence of a secretory machinery that targets and discharges vesicle-resident antimicrobial cargo towards the fungal intruder into the extracellular space. However, the exact mechanism underlying focal SNARE protein accumulation at incipient entry sites remains elusive. In addition, it remains to be shown whether SNARE proteins must be concentrated at these sites to confer effective disease resistance. To reveal the specificity of focal PEN1 accumulation at the cell periphery diverse pathogenic interactions involving direct penetrating fungi were analysed using an Arabidopsis line expressing functional GFP-PEN1 driven by the 35S promoter in the pen1-1 mutant background. Neither non-adapted Magnaporthe grisea, Phakopsora pachyrhizi, or Colletotrichum destructivum nor adapted Hyaloperonospora parasitica or Colletotrichum higginsianum ascomycetes/oomycetes triggered detectable GFP-PEN1 accumulation. However, GFP-PEN1 accumulated at interaction sites with both non-adapted and adapted powdery mildews Erysiphe pisi, Blumeria graminis f sp. hordei, and Golovinomyces orontii. This suggests that only powdery mildews trigger PEN1 focal accumulation or that the other tested fungi/oomycetes suppress or avoid PEN1 accumulation at entry sites. It is conceivable that in pathogenic interactions where PEN1 accumulation was undetectable other syntaxins might become concentrated. Since PEN1 accumulation was detectable during compatible interactions with adapted and incompatible interactions with non-adapted powdery mildews, focal PEN1 concentration per se does not predict effective resistance responses. It is possible that the adapted powdery mildew fungi intercept the SNARE protein-dependent resistance response through inhibition of ternary SNARE complex formation or of other components in this secretory pathway. Alternatively, virulent powdery mildews might have the ability to detoxify PEN1-delivered antimicrobial cargo. Unexpectedly, GFP-PEN1 was also detected in the interior of haustorial encasements after fungal entry into epidermal cells in about 10% of G. orontii interaction sites containing a haustorial complex. Whilst haustoria are essential for pathogenesis and nutrient uptake, haustorial encasements are presumed to terminate fungal growth. Of eight additional tested transgenic lines, each expressing a different fluorochrome-tagged fusion protein known to accumulate at incipient powdery mildew entry sites, only YFP-SNAP33 accumulated at a higher incidence (~25%) at haustorial encasements. These findings support previous ideas that haustorial encasements might be an extension of cell wall-associated defense responses at the cell periphery. In a second experimental approach, I have developed a novel method for confocal high-throughput imaging at subcellular resolution. I have generated a chemically mutagenized M2 population of an Arabidopsis line expressing functional GFP-PEN1 driven by the 35S promoter in the pen1-1 mutant background. Following inoculation with B. g. hordei conidiospores, I aimed to identify mutant lines showing an aberrant PEN1 focal accumulation pattern at attempted fungal entry sites. Of several identified M2 candidates, one line, tentatively designated defect in focal accumulation 1 (dfa1), was validated in selfed M3 progeny. This line shows a reduced incidence of PEN1 accumulation beneath B. g. hordei appressoria. Further genetic and molecular characterization of this mutant line should provide deeper insights in mechanisms underlying the polar accumulation of PEN1 syntaxin upon powdery mildew attack.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Molekulare Charakterisierung der Pathogen ausgelösten Zellpolarität German
Translated abstract:	Abstract Language Zellpolarität ist eine übliche Reaktion einzelner Pflanzenzellen auf bakteriellen oder pilzlichen Befall, der typischerweise zu Reorganisation des Zytoskeletts und gerichteter Bewegung von verschiedenen Organellen, wie Zellkern oder Golgi Apparat in Richtung der Penetrationsstelle an der Zelloberfläche führt. Dieser Prozess wird begleitet von der Relokalisation verschiedener Proteine und gerichtetem Vesikeltransport. Diese führen möglicherweise zur fokalen Deposition von de novo synthetisiertem Zellwandmaterial (genannt Papille) zwischen Zellwand und Plasmamembran unter der Pathogen Kontaktstelle. Seit einiger Zeit wird angenommen, dass sekretorische Prozesse, bei denen Vesikelinhalte mit antimikrobiellem Inhalt und Zellwand-Bausteinen abgesondert werden, an pflanzlicher Abwehr beteiligt sind. Erst kürzlich wurde genetisch belegt, dass �soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptors� (SNARE) Proteine, die an intrazellulären Vesikelfusionen in veschiedenen Eukaryoten beteiligt sind, für Resistenzreaktionen benötigt werden. Ein ternärer SNARE Komplex aus membrangebundenem PEN1 Syntaxin, SNAP33 und endomembrangebundenem VAMP721/722 ist essentiell für die Begrenzung des Eintritts verschiedener getesteter Mehltaupilze in Epidermiszellen von Blättern. Fokale Akkumulation jeder dieser drei Proteine an Pilzeintrittsstellen impliziert die Existenz eines sekretorischen Mechanismus, welcher Vesikel mit antimikrobiellem Inhalt gezielt transportiert und an der Interaktionsstelle in den extrazellulären Raum entlässt. Jedoch bleibt der exakte Mechanismus, der der fokalen SNARE Protein Akkumulation an der Penetrationsstelle unterliegt, unklar. Außerdem bleibt zu zeigen, ob die Konzentration der SNARE Proteine an diesen Stellen für effektive Abwehr erhöht sein muss. Um die Spezifität der fokalen PEN1 Akkumulation an der Zellperipherie zu untersuchen, wurden diverse Pathogeninteraktionen von direkt penetrierenden Pilzarten analysiert. Dabei wurde eine Arabidopsis Linie verwendet, die ein funktionelles GFP-PEN1 Fusionsprotein exprimiert. Weder die nichtadaptierten Ascomyceten Magnaporte grisea, Phakopsora pachyrhizi oder Colletotrichum destructivum noch der adaptierte Oomycete Hyaloperonospora parasitica bzw. der Ascomycet Colletotrichum higginsianum lösten eine detektierbare GFP-PEN1 Akkumulation aus. Jedoch akkumulierte GFP-PEN1 an Interaktionsstellen von den nichtadaptierten und adaptierten Mehltaupilzen Erysiphe pisi, Blumeria graminis f sp. hordei, und Golovinomyces orontii. Das deutet darauf hin, dass nur Mehltaupilze die fokale Akkumulation von PEN1 auslösen oder dass die anderen getesteten Pilze bzw. Oomyceten die fokale Akkumulation von PEN1 unterdrücken oder verhindern. Möglicherweise werden an Pathogen Interaktionsstellen, an denen die PEN1 Akkumulation nicht detektierbar ist, andere Syntaxine konzentriert. Da PEN1 Akkumulation in kompatiblen und inkompatiblen Interaktionsstellen mit adaptiertem und nichtadaptiertem Mehltau detektiert wurde, bestimmt die fokale PEN1 Akkumulation nicht per se die effektive Resistenzreaktion. Wahrscheinlich unterbinden adaptierte Mehltaupilze die SNARE Protein abhängige Resistenzreaktion durch Inhibierung der Ternärkomplexbildung oder anderer Komponenten dieses Sekretionsweges. Alternativ könnten virulente Mehltaupilze die Fähigkeit besitzen PEN1-ausgeschütteten antimikrobiellen Inhalt zu detoxifizieren. Unerwarteterweise konnte an 10% der Interaktionsstellen mit Haustorien GFP-PEN1 auch im Inneren der haustoriellen Ummantelung von G. orontii nachgewiesen werden. Haustorien sind essentiell für Pathogenese und Nährstoffaufnahme, daher wird vermutet, dass eine haustorielle Ummantelung das Pilzwachstum begrenzt. Es wurden acht weitere transgene Linien getestet, die jeweils unterschiedliche fluorochrom-markierte Fusionsproteine exprimieren, von denen bekannt ist, dass sie an Mehltau Interaktionsstellen akkumulieren. Nur YFP-SNAP33 akkumulierte zu einem höheren Prozentsatz (25%). Diese Ergebnisse unterstützen die bisherige Vermutung, dass die haustorielle Ummantelung eine Erweiterung der zellwandassoziierten Abwehrreaktion an der Zellperipherie ist. In einem zweiten experimentellen Ansatz wurde eine neue Methode der konvokalen Hochdurchsatz Mikroskopie auf subzellulärer Ebene entwickelt. In einer mutagenisierten M2 Population einer Arabidopsis Linie, die funktionelles GFP-PEN1 exprimiert, sollten Mutanten Linien identifiziert werden, die eine abweichende fokale Akkumulation von PEN1 an der Penetrationsstelle nach B. g. hordei Infektion aufweisen. Diese Musterung resultierte in der Identifizierung der dfa1 Mutante (defect in focal accumulation 1), die eine reduzierte Häufigkeit von PEN1 Akkumulationen unterhalb von B. g. hordei Appressorien zeigte. Weitere genetische und molekulare Charakterisierungen sollten Erkenntnisse über die Mechanismen der fokalen Akkumulation des PEN1 Syntaxins nach Mehltau Befall liefern. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Meyer, Dorit dmeyer@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-24554
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Zellpolarität, gerichterter Vesikeltransport, SNARE Proteine, haustorielle Ummantelung, konfokale Hochdurchsatz Mikroskopie German cell polarity, directed vesicle trafficking, SNARE proteins, haustorial encasement, confocal highhroughput microscopy English
Date of oral exam:	22 June 2008
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2455