Quantitative genetic analysis of temperature entrainment in the Arabidopsis thaliana circadian clock

Boikoglou, Eleni (2008). Quantitative genetic analysis of temperature entrainment in the Arabidopsis thaliana circadian clock. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The circadian clock is an internal mechanism that measures external time and generates overt rhythms. About 90% of the transcripts in the Arabidopsis thaliana genome are rhythmically expressed (Michael et al., 2008). Thus, all cellular process can be clock controlled to generate rhythmic physiological responses. Mathematical modeling predicted that the basic clock framework that generates various rhythmic outputs is comprised of three interlocking-feedback loops. The 24-hour rhythms are generated by the main CCA1/LHY-TOC1 feedback loop (Alabadi et al., 2001). Other genes, such as PRR7/PRR9 and GI, were shown to participate in morning or evening loops to fine tune rhythmicity (Locke et al., 2006; Zeilinger et al., 2006). This model takes in account experimental data generated under light-dark cycles. From this model, we can now hope to add environmental inputs, such as light and temperature entrainment, as integrated mechanisms within the circadian oscillator. What is relevant here is that in addition to light, temperature can also entrain the circadian oscillator. Whereas some understandings of light effects are known, it remains unclear how temperature sets the plant-circadian clock. In this thesis, I investigated temperature entrainment, as compared to light-dark entrainment, on the Arabidopsis thaliana circadian clock. For this, natural variation present in two Recombinant Inbred Lines (RILS) was exploited. The RILS were transformed with a circadian controlled and temperature regulated promoter::reporter construct. Period analysis of this CCR2 reporter after both entrainments revealed a number of Quantitative Trait Loci (QTL) for each collection assayed. The findings suggested that the circadian clockwork after light-dark and temperature entrainment is controlled by both the same, as well as by different, QTLs. Additionally, it was shown that significant allelic interactions modify the period of CCR2. A QTL that was detected, specifically, after temperature entrainment was delineated by fine-mapping procedure. Previous natural-variation studies in the vast majority of pre-existing RILs exploited the variation of two diverse ecotypes, of otherwise rarely used genetic backgrounds. This caveat restricts QTL fine mapping. To confront this disadvantage, six new RILs were generated by pairwise crosses between the four most commonly lab accessions: Columbia, C24, Landsberg erecta, and Wassilewskija. The latter two accessions were previously transformed with CCR2::LUC and used as pollen donor on the other three as a female recipient. All RIL populations were selected for short or long period of CCR2 after light-dark entrainment. Assessment of flowering-time variation under inductive long days, and circadian rhythmicity of CCR2::LUC was measured after light-dark and temperature entrainment. QTL mapping led to the identification of QTLs controlling these two processes. The traits shared some correlations. The majority of the above described QTLs under these two entrainments co-localized with already known components of the circadian oscillator. An alternative approach to physiologically map the role of already known clock genes after temperature-entrainment was thus taken. The transcriptional kinetics of CAB2, CCA1, LHY, TOC1, CCR2, GI, ELF3, and ELF4 were assayed under various light-dark and temperature entrainment protocols. Each promoter displayed unique responses to the different protocols assessed. This suggested that the circadian oscillator is a dynamic mechanism that is able to respond at a variety of signal changes within the ambient environment. The key role of two evening expressed genes, TOC1 and GI, was further defined through the use of genetics, in response to temperature entrainment. A model for GI as a light resettor and TOC1 as a thermal resettor was proposed.

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Thesis (PhD thesis)

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Title	Language
Quantitativ genetische Analyse die Temperatur Anpassung die zirkadianen Uhr in Arabidopsis thaliana	German

Translated abstract:

Abstract

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Der circadiane Rhythmus ist ein innerer Mechanismus, der äußere Zeitgeber misst und einen offenen Rhythmus erzeugt. Etwa 90% der Transkripte des Arabidopsis thaliana Genoms sind rhythmisch expremiert (Michael et al., 2008). Somit können alle zellulären Prozesse durch die innere Uhr kontrolliert werden, um rhythmische physiologische Antworten zu generieren. Mathematische Modelle sagen voraus, dass das Grundgerüst der inneren Uhr, das verschiedene rhythmische Leistungen hervorbringt, aus drei ineinander greifenden Rückkopplungsschleifen besteht. Die 24-Stunden-Rhythmen werden durch die Hauptrückkopplungsschleife CCA1/LHY-TOC1 erzeugt (Alabadi et al., 2001). Für andere Gene, wie PRR7/PRR9 und GI, wurde gezeigt, dass sie Teil der Morgen- oder Abend-Schleifen sind, um die Rhythmik fein abzustimmen (Locke et al., 2006; Zeilinger et al., 2006). Dieses Modell berücksichtigt experimentelle Daten, die unter Licht-Dunkel-Zyklen gewonnen wurden. Basierend auf diesem Modell können wir jetzt hoffen, Umwelteinflüsse wie Licht- und Temperaturabstimmung als integrierte Mechanismen innerhalb des circadianen Oszillators hinzuzufügen. Hierbei relevant ist, dass zusätzlich zum Licht auch die Temperatur den circadianen Oszillator modifizieren kann. Während bereits einige Kenntnisse über die Lichteffekte existieren, bleibt es unklar, wie die Temperatur die innere Uhr der Pflanzen justiert. In dieser Doktorarbeit habe ich die Temperaturanpassung im Vergleich zur Licht-Dunkel-Anpassung der inneren Uhr von Arabidopsis thaliana untersucht. Dafür wurden natürliche Variationen zwischen zwei rekombinanten Inzuchtlinien (Recombinant Inbred Lines, RILs) ausgenutzt. Die Inzuchtlinien wurden mit einem circadian kontrollierten und temperaturregulierten Promotor::Reporter Konstrukt transformiert. Die Analyse der Periode dieses CCR2 Reporters nach beiden Abstimmungen zeigte eine Reihe von QTLs (Quantitative Trait Loci) auf, die für diese Kollektion untersucht wurden. Die Befunde weisen darauf hin, das die circadiane Uhr nach Licht-Dunkel- und Temperatur-Anpassung von sowohl denselben, als auch von verschiedenen QTLs kontrolliert wird. Zusätzlich wurde gezeigt, dass signifikante Interaktionen zwischen den Allelen die Periode von CCR2 modifizieren. Ein QTL wurde speziell nach Temperatur-Anpassung identifiziert und durch Fein-Kartierung abgegrenzt. Vorangegange Studien über natürliche Variation der großen Mehrheit bereits existierender RILs nutzte die Variation zweier verschiedener Ökotypen mit einem selten genutzten genetischen Hintergrund. Dieser Vorbehalt schränkte die QTL-Feinkartierung ein. Um diesem Nachteil entgegenzuwirken, wurden sechs neue RILs durch paarweises Kreuzen zwischen den vier häufigsten Labor-Ökotypen, Columbia, C24, Landberg erecta, und Wassilewskija, generiert. Die beiden letzteren wurden zuvor mit CCR2::LUC transformiert und als Pollenspender für die anderen drei weiblichen Empfänger genutzt. Alle RIL Populationen wurden für kurze oder lange Perioden des CCR2 nach Licht-Dunkel-Anpassung ausgewählt. Die Bestimmung von Blühzeitpunktvariationen unter induktiven Langtagbedingungen und die circadiane Rhythmik von CCR2::LUC wurden nach Licht-Dunkel und Temperatur-Anpassung gemessen. QTL Kartierung führte zur Identifikation von QTLs, die diese beiden Prozesse kontrollieren. Beide Merkmale teilten einige Korrelationen. Die Mehrzahl der oben beschriebenen QTLs unter diesen zwei Anpassungen colokalisierte mit bereits bekannten Komponenten des circadianen Oszillators. Deshalb wurde ein alternativer Ansatz unternommen, um die Rolle von bereits bekannten Uhr-Genen nach Temperatur-Anpassung physiologisch zu entschlüsseln. Die Transkriptionskinetik von CAB2, CCA1, LHY, TOC1, CCR2, GI, ELF3, und ELF4 wurde unter verschieden Licht-Dunkel- und Temperatur-Anpassungsprotokollen untersucht. Jeder Promotor zeigte einzigartige Antworten auf die verschiedenen, angewendeten Protokolle. Dies deutet an, dass der circadiane Oszillator ein dynamischer Mechanismus ist, der in der Lage ist, auf eine Vielfalt von Signaländerungen in der umgebenden Umwelt zu antworten. Die Schlüsselrolle zweier abends expremierter Gene, TOC1 und GI, wurde weiter durch den Gebrauch von Genetik in Reaktion auf Temperatur-Anpassung bestimmt. Ein Modell für GI als Licht-Rücksetzer und TOC1 als Temperatur-Rücksetzer wurde vorgeschlagen.

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