Universität zu Köln

Pusch, Stefan Rene (2008). Interaktionsanalyse von CDKA;1 und anderen Zellzyklusregulatoren aus Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Der Zellzyklus ist für alle Lebewesen von zentraler Bedeutung und obliegt einer strengen Regulation. Zum einen muss sichergestellt werden, dass in der S-Phase die DNA exakt repliziert wird. Zum anderen ist es wichtig, dass die replizierten Chromosomen gleichmäßig in der Mitose auf die sich bildenden Tochterzellen verteilt werden. Darüber hinaus wird der Zellzyklus von entwicklungsspezifischen und umweltabhängigen Faktoren kontrolliert, die bestimmen, ob noch mehr Zellen gebildet werden. So wird der Zellzyklus insbesondere am Übergang in die S-Phase und am Eintritt in und Austritt aus der Mitose reguliert. Zentrale Regulatoren sind die Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs). Diese phosphorylieren eine Vielzahl anderer Proteine, die dadurch aktiviert oder inaktiviert werden und damit ein Voranschreiten im Zellzyklus bedingen. In Pflanzen ist allerdings sehr wenig über die möglichen Substrate von CDKs bekannt. So war das Hauptziel dieser Arbeit, Interaktionen aus einem Split-Ubiquitin Screen mit CDKA;1 aus Arabidopsis thaliana zu verifizieren und weiter zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurde ein �Bimolecular Fluorescence Complementation� (BiFC) System genutzt. Für die genaue Untersuchung der CDKA;1 wurden verschiedene CDKA;1 Varianten erstellt, die die unterschiedlichen Phosphorylierungs-Zustände der CDKA;1 imitieren sollten. Wie sich herausstellte, haben diese Varianten unterschiedliche Affinitäten zu bona fide Substraten von der CDKA;1 homologen CDC2, CDC28 und Cdk1. Dies ermöglichte es unter Zuhilfenahme des BiFC-Systems, zwischen der Interaktion eines CDKA;1 Substrates und eines Bindungspartners zu unterscheiden. So konnten aus den noch unbekannten Interaktionen des Split-Ubiquitin Screens mindestens drei neue mögliche Substrate von CDKA;1 identifiziert werden. Insgesamt wurden 27 Interaktoren aus dem Split-Ubiquitin Screen getestet, wovon 19 Interaktionen in planta bestätigt werden konnten. Darüber hinaus wurden auch Interaktionen von CDKA;1 und anderer CDKs (CDKBs, CDKDs und CDKF;1) mit weiteren Zellzyklus-Regulatoren analysiert, bzw. weitere Interaktionen von anderen Zellzyklus-Regulatoren untersucht. Viele Interaktionen im Zellzyklus sind Zellzyklusphasen-spezifisch. Deshalb und auch für weitere Untersuchungen des Zellzyklus in Pflanzen wurden im letzten Teil der Arbeit Marker entwickelt, um die vier Phasen des Zellzyklus in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Diese Marker basieren auf den vier fluoreszierenden Proteinen CFP, GFP, YFP und RFP. Für jede Zellzyklus-Phase wurde mindestens ein Konstrukt erstellt, das eines dieser fluoreszierenden Proteinen enthält. Diese Marker konnten schon in Arabidopsis thaliana gebracht werden und stehen nun für eine in vivo Analyse bereit.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Interaction analysis of CDKA;1 and other cellcycle regulators of Arabidopsis thaliana English
Translated abstract:	Abstract Language The cell cycle is of fundamental importance for all living organisms and needs to be tightly controlled. On the one hand, the DNA has to be exactly replicated in the S-phase. On the other hand, the replicated chromosomes have to be equally distributed in to the two newly forming daughter cells in mitosis. In addition, the cell cycle is also regulated by developmental and environmental factors that control the number and size of cells. The cell cycle is particularly controlled at the transition into S-phase and at the start and end of mitosis. The main regulators are the cyclin-dependent kinases (CDKs). They phosphorylate a large number of other proteins, which are then activated or inactivated and promote the progression through the cell cycle. In plants, however, there is only very little known about CDK-substrates. The main aim of this thesis was the verification and further characterization of interactors of CDKA;1 from Arabidopsis thaliana. These interactors were previously found in a split-ubiquitin screen and were analysed here using a bimolecular fluorescence complementation (BiFC) system. For further analyses of CDKA;1, several CDKA;1 variants were constructed that mimicked the different states of phosphorylation. These different variants displayed different affinities for bona fide substrates of the CDKA;1 homologs CDC2, CDC28 and Cdk1. Exploiting this behaviour, the BiFC system was used to distinguish putative substrates of CDKA;1 from other interacting partners. By this way, at least three new substrates could be identified among the interactors found by the split-ubiquitin screen. A total of 27 interactors from the split-ubiquitin screen were tested, the interaction could be confirmed for 19 of them in planta. Furthermore interactions of CDKA;1 and other CDKs (CDKBs, CDKDs and CDKF;1) with different other cell cycle regulators were analysed. In addition, interactions of other cell cycle regulators were characterized. Often, interactions during the cell cycle are cell cycle phase specific. For that reason as well as to have a tool for further studies in hand, a marker system for cell cycle phases in living cells was established. This marker is based upon four fluorescent proteins (CFP, GFP, YFP and RFP) and for every cell cycle phase one construct was created that fluoresces in a different colour. These markers are transformed into Arabidopsis thaliana plants and are now ready for in vivo analysis. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Pusch, Stefan Rene ste.pusch@t-online.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-25577
Date:	2008
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language BiFC, CDKA;1, Interaktionsanalyse, Arabidopsis German BiFC, CDKA;1, Interactionassay, Arabidopsis English
Date of oral exam:	16 November 2008
Referee:	Name Academic Title Schnittger, Arp Priv.-Doz. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2557