Identification of pathogenicity genes in the crucifer anthracnose Colletotrichum higginsianum, using random insertional mutagenesis

Huser, Aurelie (2008). Identification of pathogenicity genes in the crucifer anthracnose Colletotrichum higginsianum, using random insertional mutagenesis. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The crucifer anthracnose agent Colletotrichum higginsianum is an ascomycete fungus which can be genetically transformed. The pathogen uses a two-stage hemibiotrophic infection process, initially growing biotrophically inside a living host cell before switching to a destructive and invasive necrotrophic phase. In this study, the Arabidopsis thaliana � C. higginsianum pathosystem was used to identify fungal pathogenicity genes required for different steps of this infection process. A library of 8,850 random insertional transformants of C. higginsianum was generated by Agrobacterium tumefaciens�mediated transformation and screened for mutants failing to cause disease on A. thaliana plants. Forty pathogenicity mutants were identified and subjected to cytological analysis to characterise their infection phenotypes. Six mutants failed to form melanised appressoria, fifteen had reduced ability of penetrating the host, fourteen induced more visible host defence responses such as the hypersensitive response or callose deposition and five were reduced in their ability to enter the necrotrophic stage. The tagged genes were isolated from twelve mutants by obtaining the DNA sequence flanking the T-DNA insertions using thermal asymmetric interlaced PCR and inverse PCR and using these to screen a genomic DNA library. The putative pathogenicity genes identified showed homology to phosphate transporter, genes involved in arginine biosynthesis (carbamoyl phosphate synthetase and ARG-6 precursor), ornithine decarboxylase, importin ß, ATP-binding endoribonuclease, ß-1,3(4)-glucanase and five fungal hypothetical proteins. Two further predicted open reading frames had no significant homology to known proteins. To verify that the mutations in these genes are indeed responsible for the observed pathogenicity phenotypes, complementation with the wild-type gene and/or targeted gene disruption are required. Selected mutants were characterised in more detail. This includes a putative Major Facilitator Superfamily transporter tagged in penetration mutant path-12. A role in phosphate uptake for this protein was confirmed using complementation of yeast phosphate transporters mutant and rescue of the pathogenicity phenotype by supplementation of phosphate in plant tissue. Expression analysis indicates the transporter is expressed duringgermination, appressorium ormation and during the biotrophic phase, when phosphate availability is suggested to be limited. Apart for ornithine decarboxylase, none of these genes identified in this study were previously reported to play roles in fungal pathogenicity. Further functional characterisation of these genes should give new insights into the establishment and maintenance of biotrophy and the switch to necrotrophy in C. higginsianum.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Identifiezierung von Pathogenitaetsfaktoren im dem Antracnose Pathogen Colletotrichum higginsianum mit Hilfe von insertionaler Mutagenese	German

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Abstract

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Das Kruziferen Anthracnose Pathogen Colletotrichum higginsianum ist ein Ascomycet welcher genetisch transformiert werden kann. Die Pathogenese erfolgt in zwei Phasen bei der das Pathogen zunächst innerhalb einer intakten Wirtszelle biotrophisch wächst und anschließend zu einem invasiven nekrotrophischen Wachstum wechselt, welches die befallenen Wirtszellen zerstört. In dieser Arbeit wurde das Arabidopsis thaliana � C. higginsianum Pathosystem zur Identifizierung von Pathogenitätsfaktoren von Pilzen, die für die verschiedenen Schritte des Infektionsprozesses essentiell sind, eingesetzt. Eine Sammlung von 8,850 zufällig inserierten C. higginsianum Mutanten wurde durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelter Transformation generiert und nach den Mutanten gemustert, die für A. thaliana nicht mehr pathogen sind. Insgesamt wurden 40 Pathogenitätsmutanten identifiziert und deren Infektionsphänotypen cytologisch untersucht. Sechs Mutanten generierten keine melanisierten Appressorien, 15 Mutanten wiesen reduzierte Penetration des Wirtes auf. Vierzehn Mutanten induzierten stärker sichtbare Wirtsabwehrmechanismen, wie z.B. eine hypersensitive Reaktion oder Kalloseeinlagerungen. Fünf zeigten eine reduzierte Fähigkeit von der biotrophen in die nekrotrophe Wachstumsphase zu wechseln. Markierte Gene von 12 Mutanten wurden isoliert, indem deren DNA Sequenzen, die die TDNA Insertionen flankieren, durch �thermal asymmetric interlaced PCR� und inverse PCR identifiziert wurden und diese Sequenzen anschließend für die Musterung von genomischen DNA-Banken verwendet wurden. Die identifizierten putativen Pathogenitätsfaktoren wiesen Homologie zu Phosphattransporter, Gene involviert in der Arginin-Biosynthese (Carbomylphosphatsynthetase und eine ARG-6 Vorstufe), Ornithindecarboxylase, Importin β, ATP-bindende Endoribonuclease, β-1,3(4)-Glucanase und fünf hypothetischen Proteinen auf. Zwei weitere prognostizierte offene Leserahmen wiesen keine signifikante Homologie zu bekannten Proteinen auf. Um zu bestätigen, dass die Mutationen in diesen Genen den beobachteten Pathogenitätsphänotyp determinieren, wurden Komplementationen mit dem Wildtypgen und/oder dem gezielt disruptierten Gen benötigt. Ausgewählte Mutanten wurden detaillierter charakterisiert. Das beinhaltete auch den putativen �Major Facilitator Superfamily� Transporter der in der Penetrationsmutante path-12 markiert ist. Eine Rolle in der Phosphataufnahme wurde für dieses Protein durch die Komplementierung des Phosphattransporters von Hefe und durch die Komplementierung des Pathogenitätsphänotyps durch die Zugabe von Phosphat zu pflanzlichem Gewebe bestätigt. Expressionsanalysen weisen darauf hin, dass der Transporter während der Keimung, der Appressoriumbildung und der biotrophen Phase expremiert wird, bei denen Phosphatverfügbarkeit vermutlich limitiert ist. Abgesehen von ornithindexarboxylase ist für keines der hier identifizierten Gene bisher eine Rolle in der Pathogenität von Pilzen beschrieben worden. Weitere funktionelle Charakterisierungen dieser Gene werden neue Einblicke in die Aufrechterhaltung von Biotrophie und dem Wechsel zu Nektrotophie von C. higginsianum geben.

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