Universität zu Köln

Hermkes, Rebecca Gertrud Ellen (2008). Investigation of mutants and substrates of the Arabidopsis SUMO conjugating system. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

SUMOylation is a posttranslational modification of proteins that is found in the eukaryotic kingdom, but not in bacteria or archeae. During this process, SUMO, the Small Ubiquitin related modifier protein, is covalently attached onto its targets via an enzymatic cascade. SUMOylation can prevent or induce other modifications of the substrate, can lead to conformational changes and generates or abolishes binding interfaces. SUMOylation can therefore change the localization, activity, interactions or life span of a protein. Although SUMOylation is vital in the model plant Arabidopsis thaliana (Saracco et al., 2007), only little is known about regulation and substrates of SUMO conjugation, as the temporary nature of this modification and the fact that only a small subset of substrate is modified at a given time, makes the study of SUMOylation in plants extremely difficult. In this work, several aspects of Arabidopsis SUMOylation are discussed: � An in vitro SUMOylation assay that utilizes plant recombinant proteins was developed. This system allows quick analysis of potential SUMOylation enzymes and substrates in vitro. � The features of a SUMO1 variant, SUMO1 Q90A, in which a conserved glutamine residue at position -4 from the carboxyl terminus is changed to alanine, were analyzed in vitro. It was shown that this mutant variant leads to increased conjugate stability towards Early in Short Days 4 (ESD4), a major SUMO protease of Arabidopsis. As SUMO1 Q90A did not differ during conjugation from the wild type SUMO1 in vitro, this variant might be a valuable tool for future experiments to generate SUMOylated proteins, which are easier to detect and to analyze due to increased stability. � Analysis of the potential SUMO ligases PIAS-LIKE1 (PIL1) and PIAS-LIKE2 (PIL2) indicated a slight contribution to bulk SUMO conjugation and only a minor role in flowering time regulation compared to the already well described SUMO ligase SIZ1, strengthening the importance of SIZ1 as major Arabidopsis SUMO ligase. � Plants with mutation in the SUMO protease ESD4 have growth defects with similarity to those of plants mutated in SIZ1. In contrast to siz1 mutants, however, the growth defect of esd4 mutants is not due to altered levels of the stress hormone salicylic acid. Furthermore, studies of the related SUMO protease Early in Short Days-Like1 (EL1) demonstrated that the latter enzyme does not localize to the nucleus if transiently expressed in Nicotiana benthamiana, and plays no obvious role in the regulation of flowering time, as el1 mutants flower at a time similar to wild type. However, an el1 mutation in the background of ecotype Wassilwskija might cause an altered tissue composition in the shoot. � Analysis of the type III effector protein Factor X of the plant pathogen Xanthomonas campestris (in cooperation with Prof. Ulla Bonas and Robert Szczesny, University Halle) indicated no in vitro activity of this protein as SUMO, Rub1 or Ubiquitin protease. The broad variety of aspects discussed in this work emphasizes the importance and complexity of Arabidopsis SUMOylation and indicates that the understanding of this modification in plants can only be achieved by further studies and identification of in vivo SUMO substrates. In future the SUMOylation assay system, developed in this work, and the described SUMO1 Q90A variant might help to accomplish these tasks.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Untersuchung von Mutanten und Substraten des Arabidopsis SUMO-Konjugationssystems German
Translated abstract:	Abstract Language SUMOylierung ist eine post-translationale Proteinmodifikation, die bei eukaryotischen Organismen, nicht aber bei Bakterien oder Archeaen auftritt. Während dieses Prozesses wird SUMO, das Small Ubiquitin related modifier Protein, durch einen enzymatischen Zyklus kovalent an seine Zielproteine gebunden. SUMOylierung kann andere Modifikationen verhindern oder unterstützen, Konformationsänderungen hervorrufen oder Bindestellen für andere Interaktionspartner generieren oder zerstören. Folglich kann SUMOylierung die Lokalisation, Aktivität, Wechselwirkungen oder Lebenszeit des modifizierten Proteins verändern. Obwohl SUMOylierung für die Modellpflanze Arabidopsis thaliana überlebensnotwendig ist (Saracco et al., 2007), ist bisher nur wenig über ihre Regulation und die SUMO-Substrate bekannt. Die Erforschung der SUMOylierung in Pflanzen wird dadurch extrem erschwert, dass diese Modifikation nicht permanent ist und nur ein kleiner Teil des Substrates zu einem bestimmten Zeitpunkt modifiziert wird. In dieser Arbeit werden verschiedene Aspekte der SUMOylierung in Arabidopsis diskutiert: � Ein in vitro SUMOylierungsassay basierend auf pflanzlichen, rekombinanten Proteinen wurde entwickelt. Diese Methode erlaubt die schnelle Analyse potentieller SUMOylierungsenzyme und Substrate in vitro. � Die Eigenschaften eines mutierten SUMO1 mit Q90A Mutation, in dem ein konserviertes Glutamin an der Position -4 vom Carboxylterminus gegen Alanin ausgetauscht wurde, wurden ebenfalls in vitro analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese mutierte Version von SUMO1 zu einer gesteigerten Stabilität der Konjugate gegen Early in Short Days 4 (ESD4), der wichtigsten SUMO-Protease in Arabidopsis, führt. Da sich SUMO1 Q90A in vitro während der Konjugation nicht vom ursprünglichen SUMO1 unterscheidet, könnte diese Variante in zukünftigen Experimenten ein Werkzeug darstellen, um SUMOylierte Proteine zu erzeugen, die aufgrund ihrer erhöhten Stabilität leichter zu untersuchen sind. � Die Analyse der potentiellen SUMO-Ligasen PIAS-LIKE1 (PIL1) und PIASLIKE2 (PIL2) impliziert sowohl einen geringen Effekt dieser Proteine auf die Häufigkeit an SUMO-Konjugaten in der Pflanze, als auch eine untergeordnete Rolle bei der Blühzeitpunktkontrolle im Vergleich zu der bereits gut beschriebenen SUMO-Ligase SIZ1, wodurch die Rolle von SIZ1 als wichtigste SUMO-Ligase in Arabidopsis bestätigt wird. � Pflanzen mit einer Mutation der SUMO-Protease ESD4 haben einen ähnlichen Wachstumsdefekt wie Pflanzen mit einer Mutation von SIZ1. Im Gegensatz zu siz1 ist dieser Wachstumsdefekt jedoch nicht auf veränderte Level des Stresshormones Salicylsäure zurückzuführen. Darüber hinaus haben Untersuchungen der ähnlichen SUMO-Protease Early in Short Days- Like1 (EL1) gezeigt, dass dieses Enzym bei transienter Expression in Nicotiana benthamiana nicht im Nukleus lokalisiert ist und dass es keine offensichtliche Rolle in der Regulation des Blühzeitpunktes spielt, da el1 Mutanten zu einem ähnlichen Zeitpunkt wie der Wildtyp blühen. Allerdings scheint eine el1 Mutation im Ökotypen-Hintergrund Wassilewskija eine veränderte Gewebezusammensetzung im Spross hervorzurufen. � Die Analyse des Typ III-Effektors Faktor X des Pflanzenpathogens Xanthomonas campestris impliziert, dass dieses Protein in vitro weder als SUMO-, noch als Rub1- oder als Ubiquitin-Ligase aktiv ist (in Kooperation mit Prof. Ulla Bonas und Robert Szczesny, University Halle). Die Bandbreite an Aspekten, die in dieser Arbeit besprochen wird, zeigt die Wichtigkeit und Komplexität der SUMOylierung in Arabidopsis auf. So wird deutlich, dass ein besseres Verständnis dieser Modifikation in Pflanzen nur durch weitere Untersuchungen und durch die Identifikation von SUMO-Substraten in vivo erreicht werden kann. In Zukunft könnten der in vitro SUMOylierungsassay, welcher in dieser Arbeit entwickelt wurde, und die beschriebene SUMO-Variante SUMO1 Q90A dabei helfen, dieses Ziel zu erreichen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hermkes, Rebecca Gertrud Ellen hermkes@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-26287
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Arabidopsis , SUMO , in vitro SUMOylierung , PIAS-like German Arabidopsis , SUMO , in vitro SUMOyation , PIAS-like English
Date of oral exam:	1 December 2008
Referee:	Name Academic Title Coupland, George Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2628